CAR-T細(xì)胞治療臨床前藥理學(xué)模型的選擇

近日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了傳奇生物和強(qiáng)生合作研發(fā)的CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品Carvykti，用于治療復(fù)發(fā)性/難治性多發(fā)性骨髓瘤。作為全球第二款治療多發(fā)性骨髓瘤的CAR-T產(chǎn)品，Carvykti對(duì)標(biāo)由BMS和藍(lán)鳥生物合作研發(fā)的Abecma。臨床數(shù)據(jù)顯示，Carvykti的客觀緩解率（ORR）為97.9%，完全緩解率（sCR）為78.4%^[1]；Abecma的ORR為72%，sCR為28%^[2]。從數(shù)據(jù)上看，Carvykti的療效優(yōu)勢(shì)明顯。Carvykti從首次獲得臨床試驗(yàn)批準(zhǔn)到最終上市耗時(shí)接近4年的時(shí)間，而且臨床前研究也耗費(fèi)了大量的時(shí)間和精力。其間，臨床前藥物的有效性和安全性評(píng)價(jià)對(duì)于IND申報(bào)至關(guān)重要，本文將圍繞CAR-T細(xì)胞治療臨床前的研究，為大家介紹幾種藥理學(xué)模型的選擇。

體外模型
1●腫瘤靶點(diǎn)過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株
CAR-T細(xì)胞的作用機(jī)制是通過(guò)CAR分子的scFv特異性識(shí)別腫瘤靶點(diǎn)抗原，然后進(jìn)行殺傷。因此，人為構(gòu)建出表達(dá)腫瘤抗原的細(xì)胞，可以用來(lái)檢測(cè)CAR-T的殺傷能力。例如，使用慢病毒載體將CD19基因遞送至293T細(xì)胞，構(gòu)建CD19-293T過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株，使293T細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)CD19抗原，進(jìn)一步驗(yàn)證抗原表達(dá)陽(yáng)性率，并用于后期驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

圖1. CD19-293T細(xì)胞CD19抗原陽(yáng)性率檢測(cè)。圖源：賽業(yè)生物。

除了人為構(gòu)建的腫瘤細(xì)胞模型，自然表達(dá)抗原的腫瘤細(xì)胞系也被用來(lái)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的殺傷能力。殺傷效果的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)一般會(huì)用到流式細(xì)胞術(shù)、熒光素酶酶法、鉻釋放試驗(yàn)等。因此相應(yīng)的，也可以構(gòu)建：

熒光素酶穩(wěn)轉(zhuǎn)株
例如，諾華公司在2018年發(fā)表的靶向BCMA的CAR-T研究中，就使用了熒光素酶法^[3]。熒光素酶可以催化熒光素氧化，在熒光素氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光。研究者們?cè)谌硕喟l(fā)性骨髓瘤細(xì)胞KMS-11中引入螢火蟲熒光素酶（Luc）基因，構(gòu)建出KMS-11-luc細(xì)胞，然后將CAR-T細(xì)胞和KMS-11-luc細(xì)胞按不同的效靶比（E:T ratio）共孵育20小時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞混合液的熒光強(qiáng)度，可以代表剩余的靶細(xì)胞數(shù)量。

圖2. 使用熒光素酶法繪制的腫瘤細(xì)胞裂解曲線^[3]。

⁵¹Cr放射性標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞
2015年，在賓大和諾華的一項(xiàng)共同研究中，使用了鉻釋放法來(lái)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的殺傷能力^[4]。首先使用同位素⁵¹Cr標(biāo)記U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞，然后將CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞按不同的效靶比共孵育，腫瘤細(xì)胞被裂解后，⁵¹Cr從細(xì)胞中釋放至上清液，檢測(cè)上清液⁵¹Cr的含量，可以代表裂解的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。
 

圖3. 使用鉻釋放法繪制的腫瘤細(xì)胞裂解曲線^[4]。

2●Jurkat報(bào)告細(xì)胞系統(tǒng)
除了腫瘤細(xì)胞模型外，也可以用Jurkat報(bào)告細(xì)胞代替從PBMC分離并活化出的T細(xì)胞，來(lái)進(jìn)行早期的評(píng)估試驗(yàn)。Jurkat細(xì)胞是人類T淋巴細(xì)胞的永生細(xì)胞系，最初在1970年代后期，從一名患有T細(xì)胞白血病的14歲男孩的外周血中建立的。在CAR-T的體外試驗(yàn)中，Jurkat細(xì)胞常被用于T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的研究。

紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心在2019年的文章中，為了研究CAR-T細(xì)胞是否具有抗原依賴性，將紅色熒光蛋白（RFP）基因遞送至Jurkat細(xì)胞CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)的下游區(qū)，同時(shí)在CAR分子上表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP），構(gòu)建出CAR/GFP修飾的Jurkat-RFP報(bào)告細(xì)胞^[5]。綠色熒光代表CAR分子轉(zhuǎn)導(dǎo)成功，而紅色熒光代表CAR信號(hào)被成功傳導(dǎo)。研究者們將CAR/GFP修飾的Jurkat-RFP報(bào)告細(xì)胞與表達(dá)抗原的靶細(xì)胞、不表達(dá)抗原的對(duì)照細(xì)胞分別共孵育，在不表達(dá)抗原的對(duì)照組中，如果同時(shí)有綠色熒光和紅色熒光，則說(shuō)明該類別的CAR-T細(xì)胞不具備抗原依賴性，即不是理想的CAR-T細(xì)胞。
 

圖4. 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR/GFP修飾的Jurkat-RFP報(bào)告細(xì)胞的熒光表達(dá)（縱坐標(biāo)：綠色熒光；橫坐標(biāo)：紅色熒光）^[5]。

體內(nèi)模型
1●動(dòng)物腫瘤模型
在CAR-T治療的臨床前研究中，動(dòng)物腫瘤模型的藥效評(píng)價(jià)尤為重要。由于小鼠基因組與人類基因組的相似程度高，并且小鼠模型的構(gòu)建成本低，因此小鼠成為了研究人類疾病的最佳實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀６�免疫缺陷小鼠�?duì)外來(lái)移植物的排斥弱，非常適合動(dòng)物腫瘤模型的構(gòu)建。目前國(guó)際上公認(rèn)的免疫缺陷程度最高的小鼠是具有Prkdc和Il2rg基因缺陷的小鼠，這兩種基因的突變使小鼠的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性完全喪失。例如由賽業(yè)自主研發(fā)的C-NKG重度免疫缺陷小鼠（NOD/Shi-Prkdc^scid Il2rg^em1/Cgen），在NOD/Shi-scid背景品系上敲除Il2rg基因，擁有補(bǔ)體活性降低、巨噬細(xì)胞對(duì)人源細(xì)胞吞噬作用弱、樹突狀細(xì)胞功能下降、無(wú)T細(xì)胞和B細(xì)胞泄漏等特性，適合用于CDX和PDX模型的構(gòu)建、免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的制備、GvHD模型構(gòu)建和腫瘤免疫相關(guān)的研究。

除了重度免疫缺陷小鼠，裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠也可以用于腫瘤模型的構(gòu)建。裸鼠（Nude小鼠）是上世紀(jì)60年代在英國(guó)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)免疫功能障礙小鼠；重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠（Server Combined Immune-Deficiency, SCID）具有Prkdc突變，表現(xiàn)為T細(xì)胞和B細(xì)胞缺失；NOD/SCID小鼠由非肥胖糖尿�。∟OD）小鼠和SCID小鼠雜交產(chǎn)生，免疫缺陷程度進(jìn)一步提高。隨著生物科技的不斷發(fā)展與進(jìn)步，免疫缺陷動(dòng)物也在被不斷地優(yōu)化和迭代。選擇合適的免疫缺陷動(dòng)物，可以在實(shí)驗(yàn)中取得更加優(yōu)秀的成果，助力相關(guān)領(lǐng)域的研發(fā)。

腫瘤細(xì)胞系異種移植模型（Cell Line-Derived Xenograft, CDX）是將腫瘤細(xì)胞系移植到同種或異種動(dòng)物體內(nèi)形成腫瘤。腫瘤細(xì)胞系移植腫瘤保持著原發(fā)腫瘤的大部分生物學(xué)特性，成瘤效率高，實(shí)驗(yàn)周期短，因此很適合用于腫瘤藥物的早期藥效評(píng)價(jià)。在CAR-T治療的研究中，使用含有熒光素酶基因的腫瘤細(xì)胞構(gòu)建CDX模型，可以通過(guò)熒光監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)以及CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。

人源腫瘤組織異種移植模型（Patient-Derived Xenograft, PDX）是直接用患者新鮮腫瘤組織接種于免疫缺陷小鼠建立的模型。腫瘤組織在小鼠體內(nèi)環(huán)境生長(zhǎng)并傳代2-3次，可以更好地表現(xiàn)親代腫瘤性狀，并且維持了腫瘤的異質(zhì)性。與CDX模型相比，PDX模型最大的優(yōu)勢(shì)是保留了親本腫瘤的異質(zhì)性和組織學(xué)特性，例如細(xì)胞形態(tài)、血管系統(tǒng)、基質(zhì)形態(tài)等，模擬了腫瘤發(fā)生的體內(nèi)環(huán)境。
 

圖5. PDX模型的構(gòu)建流程^[6]。

同源移植模型（Syngeneic model）是將同種背景來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系接種至免疫健全的近交系小鼠。受體小鼠擁有完整的鼠源免疫系統(tǒng)，具有完全的免疫活性，且該免疫系統(tǒng)與同種移植腫瘤組織相容，能最大化模擬腫瘤微環(huán)境的真實(shí)生活情況，缺點(diǎn)是移植的小鼠組織可能無(wú)法完全代表臨床情況下人類腫瘤的復(fù)雜性。

人免疫系統(tǒng)重建動(dòng)物模型（Human immune system-engrafted models, HIS）是通過(guò)異種移植人類免疫細(xì)胞或組織和/或其祖細(xì)胞到免疫缺陷小鼠中產(chǎn)生的。這類小鼠可以更有效地模擬人體免疫應(yīng)答，為腫瘤免疫、自身免疫性疾病，以及人特異性傳染疾�。ɡ�如由人類免疫缺陷病毒HIV引起的獲得性免疫缺陷綜合征AIDS）的轉(zhuǎn)化研究提供了優(yōu)秀模型。

2●熒光素酶穩(wěn)轉(zhuǎn)株與動(dòng)物腫瘤模型聯(lián)合應(yīng)用
與體外模型構(gòu)建表達(dá)熒光素酶的腫瘤細(xì)胞的原理一致，體內(nèi)模型中，也是利用熒光素氧化發(fā)光的特性，通過(guò)活體成像儀，監(jiān)測(cè)體內(nèi)腫瘤的大小、分布，并通過(guò)平均熒光強(qiáng)度（FMI）量化腫瘤的生長(zhǎng)。例如構(gòu)建急性淋巴細(xì)胞白血病的CDX模型時(shí)，可以將熒光素酶基因遞送至人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Nalm6，構(gòu)建Luci-Nalm6細(xì)胞。將不同劑量的Luci-Nalm6接種至C-NKG和NOG小鼠中，第21天的活體成像如下圖所示。
 

圖6. 活體成像檢測(cè)Luci-Nalm6細(xì)胞異種小鼠腫瘤模型腫瘤生長(zhǎng)情況（上：第21天活體成像檢測(cè)；下：平均熒光強(qiáng)度）。來(lái)源：賽業(yè)生物。