人內(nèi)臟脂肪細胞的應(yīng)用及復(fù)蘇操作要點

 　　一、背景

　　人內(nèi)臟脂肪細胞是從臟器脂肪中分離而來。內(nèi)臟脂肪是人體脂肪中的一種，與皮下脂肪不同，它圍繞著人的臟器，主要存在于腹腔內(nèi)，對人的內(nèi)臟起著支撐、穩(wěn)定和保護的作用。與皮下脂肪庫累積導(dǎo)致的外周型肥胖相比，內(nèi)臟脂肪過度沉積與糖尿病、冠心病等一些肥胖相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，研究內(nèi)臟脂肪細胞的調(diào)節(jié)機制對于肥胖及其相關(guān)疾病的防治具有重要意義。

　　二、復(fù)蘇操作要點

　　1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

　　2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細胞)避免引起污染。

　　3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

　　4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

　　5）將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

　　6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復(fù)后才能進行后續(xù)的實驗。

　　三、應(yīng)用

　　用于Sirt1對內(nèi)臟脂肪細胞定向分化的影響及機制研究：

　　組蛋白去乙�；�酶Sirtuin-1（Sirtl）基因不僅可抑制皮下白色脂肪分化而抑制肥胖,Sirt1過表達還可促進PPAR-γ去乙�；�,招募PRDM16引起皮下白色脂肪的“米色化”而引起顯著的產(chǎn)熱效應(yīng)。但有趣的是,Sirt1轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)臟脂肪中并沒有出現(xiàn)明顯的米色脂肪,提示Sirt1對皮下與內(nèi)臟脂肪的分化調(diào)控存在差別�；�于臨床研究提示Sirt1的表達水平與內(nèi)臟脂肪沉積密切相關(guān),本研究擬從細胞及動物實驗多層面并結(jié)合Sirt1過表達及激動劑的應(yīng)用,探討Sirt1對內(nèi)臟脂肪前體分化的調(diào)控作用以及新型Sirt1激動劑BTM-0512對高脂誘導(dǎo)實驗性肥胖的抑制效果及機制。

　　方法臨床研究：按照一定的納入標準及排除標準收集腹部手術(shù)患者內(nèi)臟脂肪組織,以BMI≥25.0個體為超重/肥胖組,以BMI在18.5-24.9之間個體為對照組；免疫組織化學(xué)檢測脂肪組織中Sirt1、PRDM16蛋白表達；Real-timePCR檢測Sirt1、全長PRDM16、總PRDM16表達水平。細胞實驗：選取臨床研究中對照組患者內(nèi)臟脂肪組織進行SVF原代細胞培養(yǎng),通過流式細胞儀檢測細胞表面分子標記。構(gòu)建Human-Sirtl過表達慢病毒載體。

　　實驗分組為：①對照組,轉(zhuǎn)染慢病毒包裝的空質(zhì)粒；Sirt1過表達組,轉(zhuǎn)染慢病毒包裝的Sirt1過表達質(zhì)粒。提取細胞總RNA,Real-timePCR檢測Sirt1、全長PRDM16、總PRDM16、UCP1、C/EBPβ、Resistin的mRNA表達水平；油紅O染色檢測細胞脂質(zhì)沉積。動物實驗：高脂飲食連續(xù)飼養(yǎng)C57BL/6J小鼠8周建立肥胖模型。造模后分別給予兩種Sirtl激動劑白藜蘆醇及其甲基化衍生物BTM-0512進行治療性給藥,實驗分為對照組,模型組,BTM-0512低劑量組（5mg/kg）,BTM-0512中劑量組（10mg/kg）,BTM-0512高劑量組（20mg/kg）,白藜蘆醇組（10mg/kg）。連續(xù)給藥時間分別為2、4、6周,分別檢測體重、體長、內(nèi)臟脂肪濕重。然后選擇給藥4周小鼠,測血糖、血脂,并分別取內(nèi)臟及肩胛間脂肪,提取總RNA,Real-timePCR檢測Sirt1、全長PRDM16、總PRDM16、UCP1、C/EBPβ、Resistin、TMEM26的mRNA表達水平。

　　結(jié)果：（1）在臨床研究中,與對照組相比,肥胖人群內(nèi)臟脂肪組織中Sirt1與總PRDM16蛋白及mRNA表達下降,而全長PRDM16mRNA表達無明顯差異。

　　（2）在細胞實驗中,與對照組相比,Sirt1基因過表達組脂質(zhì)沉積明顯降低,同時,Resistin、UCP1、C/EBPβ、全長PRDM16mRNA表達水平明顯降低,總PRDM16表達兩組間無明顯差異。

　�。�3）在動物實驗中,與對照組相比,模型組血糖、血脂、體重、Lee’s指數(shù)、內(nèi)臟脂肪指數(shù)明顯升高；BTM-0512及白藜蘆醇明顯降低小鼠血糖、血脂、體重、Lee’s指數(shù)、內(nèi)臟脂肪指數(shù),且BTM-0512較白藜蘆醇作用更加明顯。

　　（4）在動物實驗中,與模型組相比,BTM-0512組和白藜蘆醇組小鼠內(nèi)臟脂肪中Sirt1、總PRDM16mRNA表達上調(diào),而全長PRDM16、UCP1、C/EBPβ、TMEM26、Resistin表達則顯著下調(diào)。

　　（5）在動物實驗中,與模型組相比,BTM0512和白藜蘆醇組小鼠棕色脂肪中Sirt1、UCP1、全長PRDM16與總PRDM16的表達皆升高,Resistin、C/EBPβ、TMEM26表達無明顯差異。

　　四、注意事項

　　1、收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

　　2、收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時（視細胞密度而定）穩(wěn)定細胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進行銷售依據(jù)。

　　3、由于細胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊懀�故本公司只保證客戶收到細胞后一周內(nèi)的細胞狀態(tài)，故客戶需要售后時需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。

　　4、所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。