在人體血清中,通過(guò)免疫實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)新冠抗體是增進(jìn)我們了解這種疾病以及疫苗研究的重要工具。Promega Lumit
Dx SARS-CoV-2 免 疫 實(shí) 驗(yàn) 使 用了 帶 有 SmBiT 和 LgBiT ( 這是 NanoLuc 熒光素酶的兩個(gè)亞基,只有當(dāng)它們通過(guò)結(jié)合相互靠近時(shí),才具有功能 ) 標(biāo)記的新冠病毒刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)域(RBD) 的一個(gè)片段。當(dāng)這些標(biāo)記過(guò)的病毒蛋白片段與含有新冠病毒抗體的樣品一起孵育時(shí),他們將與抗體結(jié)合,將 SmBiT和 LgBiT 兩個(gè)亞基結(jié)合到一起,并產(chǎn)生功能性的熒光素酶。添加 Lumit 檢測(cè)試劑,在微孔板光度計(jì)上測(cè)量產(chǎn)生的熒光信號(hào)。
Lumit 實(shí)驗(yàn)中,樣品的添加和測(cè)讀如圖 1 所示。沒(méi)有清洗的步驟并且一小時(shí)內(nèi)測(cè)得結(jié)果,使得這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以應(yīng)用于高通量篩選。SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀具有超冷光電倍增管(PMT),可以為 Lumit Dx 新冠病毒免疫實(shí)驗(yàn)提供高靈敏度的發(fā)光檢測(cè)。
優(yōu)點(diǎn)
•放大高通量篩選,省去清洗步驟,
•樣品體積僅需 15 微升,
圖 1 Lumit Dx 新冠病毒免疫實(shí)驗(yàn)的工作流程。添加 - 孵育 - 測(cè)讀全流程將在一小時(shí)內(nèi)完成,并且可以用于自動(dòng)化和高通量篩選。
材料
• Lumit Dx 新冠病毒免疫實(shí)驗(yàn)試劑盒 (Promega cat. #VB1080)
• 新冠病毒陽(yáng)性血清樣品 (BioIVT cat. #HMSRM-COVID)
• 正常人血清 (Amsbio cat. #HSER-2mL)
• 白色 96 孔板 (Greiner cat. #655075)
• SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀 ( 美谷分子儀器 )
方法
實(shí)驗(yàn)試劑的準(zhǔn)備和微孔板的操作如下 ( 更多的細(xì)節(jié), 請(qǐng)參閱Lumit Dx 新冠病毒免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)):
1.
制備 1x Lumit-Dx 免 疫 實(shí) 驗(yàn) 稀 釋 緩 沖 液 ( 添 加 5mL 10xLumit-Dx 免 疫 實(shí) 驗(yàn) 稀 釋 緩 沖 液 至 45 mL Lumit-Dx PBS/EGTA 溶液中 )。
2.
來(lái)源于新冠患者或健康受試者的30 uL 血清樣本, 與 70 uL1x Lumit-Dx 免疫實(shí)驗(yàn)稀釋緩沖液混合。 有足夠的體積進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn); 通常每個(gè)孔僅需 15 uL 樣品。
3.
Lumit-Dx CoV-2 BiTs Master Mix 現(xiàn) 配 現(xiàn) 用, 配 方 如 下:5mL 1x Lumit-Dx 免疫實(shí)驗(yàn)稀釋緩沖液、9.4 uL Lumit-DxCoV-2 LgBiT( 紅色蓋子 )、9.4 uL Lumit-Dx CoV-2 SmBiT( 藍(lán)色蓋子 )。 添加完畢后, 輕微地顛倒混勻。
4.
Lumit-Dx 陽(yáng)性對(duì)照、Lumit-Dx 陰性對(duì)照、Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑, 解凍后放置于室溫及時(shí)使用。 簡(jiǎn)短的離心可使管壁內(nèi)容物甩至管底。
5.
按如下操作, 添加試劑至白色 96 孔板中:
• 每個(gè)孔加入 40uL Lumit CoV-2 BiTs Master Mix,
• 20uL 稀釋的病人血清樣本, 三個(gè)重復(fù),
• 20uL Lumit-Dx 陽(yáng)性對(duì)照, 三個(gè)重復(fù),
• 20uL Lumit-Dx 陰性對(duì)照, 三個(gè)重復(fù),
• 20uL Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑, 三個(gè)重復(fù),
6.
將微孔板封蓋, 室溫孵育 20 分鐘。
7.
孵育后, 制備 Lumit-Dx 檢測(cè)試劑 (7mL 1x Lumit-Dx 免疫實(shí)驗(yàn)稀釋緩沖液、230 uL Lumit-Dx 檢測(cè)底物 ( 灰色蓋子 ),現(xiàn)配現(xiàn)用。 輕微地顛倒混勻。
8.
60 uL 檢測(cè)試劑加入孔中, 室溫孵育 3 分鐘。
9.
使用 SpectraMax iD5 讀板機(jī)測(cè)讀, 如表 1 所設(shè)置。 測(cè)讀完成后, 相對(duì)發(fā)光單位 (RLUs) 顯示在 SoftMax Pro 軟件的plate 板塊中。 在模板中, 這些孔被分配到不同的組中,各組產(chǎn)生的表單被用于計(jì)算和顯示數(shù)據(jù)結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控按照試劑盒技術(shù)手冊(cè)進(jìn)行評(píng)估。 Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑、Lumit-Dx 陽(yáng)性對(duì)照、Lumit-Dx 陰性對(duì)照都被用于確保最合適的實(shí)驗(yàn)性能。 相比于 Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑, 陽(yáng)性對(duì)照必須產(chǎn)生更高的相對(duì)發(fā)光單位值, 陰性對(duì)照必須產(chǎn)生更低的相對(duì)發(fā)光單位值。 如果這些條件不滿足, 微孔板測(cè)讀結(jié)果將是無(wú)效的。
表 1 Lumit-Dx 實(shí)驗(yàn)中,SpectraMax iD5 讀板機(jī)儀器參數(shù)設(shè)置。全波長(zhǎng) ( 無(wú)波長(zhǎng)選項(xiàng) ) 設(shè)置被用于最大化的發(fā)光檢測(cè)。讀板高度在 SoftMaxPro 軟件中的讀板高度調(diào)整設(shè)置之前進(jìn)行了優(yōu)化。
結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)每一個(gè)測(cè)試樣品 (S) 的相對(duì)發(fā)光單位 (RLU) 與實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑 (C) 的平均相對(duì)發(fā)光單位的比值計(jì)算得到。 S/C 比值≥ 1, 樣品中新冠抗體為陽(yáng)性;S/C 比值< 1, 樣品中新冠抗體為陰性。 實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)試劑的平均相對(duì)發(fā)光單位是 548, 六位新冠患者樣本的平均相對(duì)發(fā)光單位從 1787 至 14155 不等, 健康受試者的相對(duì)發(fā)光單位是 86。
如表 2 顯示, 新冠患者樣本的比值都是大于 1, 顯示陽(yáng)性結(jié)果, 而健康受試者的比值都是小于 1, 顯示陰性結(jié)果。
備注: 此實(shí)驗(yàn)樣品板也在 SpectraMax i3X, SpectraMax M5,SpectraMax L 酶標(biāo)儀上測(cè)讀, 獲得相似的結(jié)果。
表 2 在 SpectraMax iD5 讀板機(jī)上獲得的 Lumit Dx 新冠病毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果。所有的樣品和實(shí)驗(yàn)對(duì)照都有三次重復(fù),并計(jì)算出變異系數(shù) CV值。運(yùn)用 SoftMax Pro 軟件計(jì)算并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
結(jié)論
研究人員通過(guò)檢測(cè)大量的新冠病毒感染患者和已接種疫苗的人的血清樣本, 進(jìn)一步了解免疫反應(yīng)發(fā)生和持續(xù)的時(shí)間, 因此,大量的血清樣本新冠抗體的快速檢測(cè)變得尤為迫切。 Lumit Dx新冠病毒免疫實(shí)驗(yàn)為科學(xué)家提供了一個(gè)簡(jiǎn)化的流程, 可以更快速地獲得結(jié)果。 聯(lián)合使用 SpectraMax iD5 讀板機(jī)和 SoftMaxPro 軟件, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算和分析更加自動(dòng)化, 減少手動(dòng)操作時(shí)間, 可以有更高的通量。
更多精彩內(nèi)容
盡在官方微信
參考文獻(xiàn)
1. Post N, Eddy D, Huntley C et al. Antibody response to
SARS-CoV-2 infection in humans: A systematic review. PLoS
ONE 15(12):e0244126 (2020)
2. Long QX, Liu BZ, Deng HJ et al. Antibody responses to
SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nat Med 26, 845–848
(2020).