定量OCTA揭示清醒與麻醉小鼠腦皮層的血管和血流差異
背景
使用活體動物模型成像腦血流（CBF）對于理解CBF調節(jié)和腦功能的機制來講意義非凡。由于在圖像采集過程中，要避免因運動產(chǎn)生的偽影，因此大部分光學成像研究都是在麻醉動物中進行。然而不同的麻醉劑會破壞基線（刺激前的靜息）血液動力學和對刺激的功能性反應，可能導致對血液動力學反應和腦血管疾病研究的實驗結果出現(xiàn)不同解釋。如使用α-氯醛糖（α-chloralose）或烏拉坦（urethane）麻醉時，腦血管對乙醇的反應為血管收縮，而氟烷（halothane）麻醉時乙醇誘導血管舒張。因此非常有必要研究麻醉對動物模型基線腦血液動力學的影響。此外有研究表明，上游動脈和皮質內(nèi)微血管可能具有單獨或獨立的機制來調節(jié)局部CBF，表明有必要從大血管和微循環(huán)（毛細血管）兩者水平上研究血管反應。
有研究報告了麻醉動物和清醒動物對功能性刺激的血液動力學反應的差異。小鼠視覺皮層的光學成像結果顯示，與麻醉期情況下相比，清醒時神經(jīng)活動后的血液動力學反應更強、更快。對大鼠的功能磁共振成像（fMRI）研究表明，烏拉坦麻醉后，胡須刺激引發(fā)的血液動力學反應的時間分布與清醒狀態(tài)不同。使用正電子發(fā)射斷層掃描（PET）對狒狒的研究中發(fā)現(xiàn)，由于ketamine麻醉對枕葉的影響，靜息CBF增加，但受限于空間分辨率，沒有探索血管形態(tài)變化。雙光子成像量化了異氟醚（isoflurane）麻醉對狨猴腦微血管的舒張作用，并顯示基線血流速度降低。然而受限于視野（FOV），僅在單個血管層面進行了分析。有研究使定量光聲顯微鏡評估了異氟醚麻醉下，小鼠腦的基線血液動力學和氧代謝的變化，但研究集中于大血管，并不包括毛細血管反應評估。鑒于基礎血液動力學參數(shù)定量信息的缺乏，以及當前成像模式的技術限制，需要對宏觀和微血管水平的麻醉效果進行更詳細的分析。
本文使用光學相干斷層掃描（OCT）探究了麻醉劑對基線狀態(tài)血管尺寸和CBF參數(shù)的影響。光學顯微血管造影術（OMAG）是OCT的一個高級擴展，其優(yōu)勢在于可以幾乎不受背景組織噪聲影響地提取血流信號，基于此發(fā)展出了另一種OCT血管造影方法，即Doppler OMAG（DOMAG）。DOMAG可檢測穿透血管中的軸向血流速度，這會揭示關于腦血流的詳細信息。OMAG和DOMAG技術的結合已廣泛用于各種腦血管研究，包括卒中、動脈新生和衰老。本研究的主要目的是證明該OCT雙圖像處理方法能夠補充且更全面地分析麻醉對腦血管形態(tài)和血流的影響。
本研究應用OMAG和DOMAG相結合的方法比較麻醉和清醒狀態(tài)下，小鼠皮層的血管和血流參數(shù)。通過測量動/靜脈直徑、毛細血管面積密度、毛細血管流量、軸向流速和總血流量的變化，系統(tǒng)評價異氟醚和ketamine-賽拉嗪對腦血管張力和血液動力學的影響。
圖1 OCT系統(tǒng)示意圖。
01-麻醉對血管舒張的影響
OMAG揭示了異氟醚和ketamine-賽拉嗪（K-X）誘導的血管擴張（圖2）。為使比較更準確，根據(jù)分支順序對靜脈和動脈分支進行分類：1段（Seg1）為最近端，2段（Seg2）在中間，3段（Seg3）為最遠端（圖2A）。圖2B和C分別為OCT獲得的皮層結構和血流橫截面圖像。從圖2C黃色和藍色線間約50μm厚的組織數(shù)據(jù)獲得OMAG血管造影圖像。圖2D-F的血管造影圖對應異氟醚麻醉、K-X麻醉和清醒狀態(tài)。從圖2G-I二元掩模（binary masks）圖像中測量Seg 1（紅色）、2（綠色）和3（紫色）的靜脈和動脈直徑值。比較三種不同方案中每個靜脈和動脈段的ΔD（圖2K-L）�？偟膩碚f，從清醒到異氟醚麻醉狀態(tài)呈增加趨勢。K-X麻醉組靜脈Seg 3的ΔD比清醒組高11 %（p = 0.0498）。異氟醚組靜脈Seg 2的ΔD比K-X組高6%（p = 0.0430），比清醒組高22%（p = 0.0198）。異氟醚組動脈Seg 1的ΔD比K-X組高12 %（p = 0.0352），比清醒組高29%（p = 0.0104）。這些結果表明，與清醒狀態(tài)相比，麻醉狀態(tài)下的靜脈和動脈直徑增加，意味著異氟醚和K-X會引起顯著的血管擴張。
圖2動靜脈段直徑的比較。（A）血管分支的分類。（B）B-scan結構截面圖像。（C）B-scan血流截面圖像。黃線表示皮質表面，藍線和綠線分別位于距皮質表面50μm和300μm深度。（D-F）不同狀態(tài)下OMAG血管造影照片，從3D OMAG數(shù)據(jù)集的正面MIP獲得，位于圖C黃色和藍色虛線之間。（G-I）分別對應D-F血管造影的血管掩膜圖像，用紫色（Seg3）、綠色（Seg2）和紅色（Seg1）表示血管直徑大小。（K-L）三種狀態(tài)下Seg 3、Seg 2和Seg 1靜脈和動脈直徑變化指數(shù)的比較。
02-毛細血管的血管面積密度和流量
比較三種不同狀態(tài)下的毛細血管的VAD（vessel area density）和流量，處理OMAG血管造影（圖3A–C）結果，排除大動脈和大靜脈（圖3D–F）。生成其余毛細血管在異氟醚、K-X麻醉和清醒狀態(tài)下的毛細血管VAD圖（圖3G-I）和流量圖（圖3K-M）。圖3N顯示了三種不同狀態(tài)下的流量指數(shù)分布符合核分布（Kernel distribution），其中觀察到異氟醚組的流量指數(shù)最大，超過平均值，而清醒組的流量指數(shù)最小。圖3O-P分別給出了三種條件下給定區(qū)域的平均VAD和平均CFI（capillary flux index）的比較。結果顯示，清醒組的平均VAD比K-X組低23%（p = 0.0368），比異氟醚組低25%（p = 0.0065）。清醒組的平均CFI比K-X組低5%（p = 0.0369），比異氟醚組低15%（p = 0.0131）�？偟膩碚f，從清醒到麻醉狀態(tài)，毛細血管VAD和平均CFI都增加了。
圖3毛細血管中VAD和流量的比較。（A-C）三種狀態(tài)下的OMAG血管造影，彩條代表信號強度高低。（D-F）不包括動脈和靜脈的OMAG血管造影。（G-I）三種狀態(tài)下的毛細管VAD圖。彩條代表局部白色像素比例，其中藍色較小，紅色較大。（K-M）三種狀態(tài)下的CFI圖。顏色條表示從0到1的強度信號。（N）三種狀態(tài)下的毛細血管通量直方圖分布符合核分布。（O）三種狀態(tài)下的平均VAD比較。（P）三種狀態(tài)下的平均CFI比較。
03-穿透血管的腦血流測量
為評估清醒狀態(tài)和麻醉狀態(tài)之間的腦血流差異，量化了一只動物的紅細胞軸向速度、血流橫截面積和總血流（圖4）。圖4A和B顯示了異氟醚麻醉和清醒狀態(tài)下的雙向正面DOMAG軸向速度圖譜。分別以綠色和紅色顯示下潛的小動脈和上行的小靜脈，以6.0mm/s范圍的彩色條編碼表示軸向流速信息。從圖4C 3D數(shù)據(jù)提取矩形切片（圖4D-E），以比較清醒組和異氟醚組間四個區(qū)域的平均軸向速度（圖4F）、流動橫截面積（圖4G）和總血流（圖4H）。從清醒到異氟醚麻醉狀態(tài)，平均流速值僅增加3%，而血流橫截面積值增加57%（p < 0.04），總血流量增加55%（p < 0.04）。此外從圖4A，B，D和E發(fā)現(xiàn)，從清醒狀態(tài)到異氟醚麻醉狀態(tài)，穿透血管密度增加，這支持了圖3G-1中毛細血管VAD結果。
圖4一只種動物腦血流參數(shù)的比較。（A-B）異氟醚和清醒狀態(tài)下小鼠皮層的雙向軸向腦血流速度圖。顏色條表示紅細胞在6.0mm/s范圍內(nèi)向下（負，綠色）和向上（正，紅色）移動的軸向速度。黃色是投影效果產(chǎn)生的綠色和紅色信號的混合。（C）從3D DOMAG數(shù)據(jù)集生成的300μm厚組織的3D可視化圖像，帶有上升和下潛的血管。（D-E）C中皮質表面以下約50mm x-y平面上的矩形切片。綠點和紅點代表血管流動橫截面。（F-H）平均軸向速度、血流橫截面積和總血流量的比較。
結論
本研究中的OMAG技術也證明可在毛細血管水平上顯示血管灌注和擴張增加。VAD描述了整體毛細血管灌注，也反映了血管大小的變化，給出了關于毛細血管擴張的信息。從清醒狀態(tài)到麻醉狀態(tài)，平均VAD增加（圖3O），表明毛細血管灌注和毛細血管擴張增加。此外，從清醒狀態(tài)到麻醉狀態(tài)，平均CFI增加（圖3P），意味著麻醉也提高了毛細血管流量。
已知大腦血管擴張導致動脈壓降低，隨后會引起CBF升高和外周血灌注。在一只動物身上進行的對比實驗發(fā)現(xiàn)，雖然紅細胞的平均軸向速度從清醒狀態(tài)到異氟醚狀態(tài)沒有顯著變化（圖4F），但流動橫截面積增加了57 %（圖4G）�？傃髁恳苍黾恿�55 %（圖4H）。與已有的結論一致，即異氟醚和ketamine會使基線CBF增加。
此外盡管成像技術發(fā)展迅速，但向完全清醒成像仍有一定難度，動物產(chǎn)生的壓力和不適會影響獲得的信號。已知麻醉劑的作用是劑量依賴性的，低異氟醚濃度（1.3%-1.5%）可保持CBF值與清醒狀態(tài)接近。因此可以在不同條件下進行實驗，并將獲得的結果進行比較，以產(chǎn)生可靠的結果。
總之，本研究使用OMAG和DOMAG技術，測量并比較了清醒與麻醉小鼠大腦血管和毛細血管網(wǎng)的基線形態(tài)學和血流參數(shù)。結果顯示異氟醚和ketamine-賽拉嗪會引起大血管和毛細血管舒張。血管尺寸的增加導致CBF增加。證明了OCT雙圖像處理方法可以補充并全面分析麻醉對腦血管和血流的影響。
參考文獻：Rakymzhan, A. , et al. "Differences in cerebral blood vasculature and flow in awake and anesthetized mouse cortex revealed by quantitative optical coherence tomography angiography." Journal of Neuroscience Methods 353.2(2021):109094.
