干細(xì)胞成骨、成脂、成軟骨三系分化 的操作方法

成骨誘導(dǎo)分化步驟

1.接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照2×104cells/cm2的細(xì)胞密度接種至包被后的培養(yǎng)器皿中，于37℃，5% CO₂培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至匯合度60-70%，棄掉上清，加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。

2.細(xì)胞分化誘導(dǎo)：每2-3天更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約14-21天，并注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞鈣鹽結(jié)晶析出和鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況，決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時間，進(jìn)行染色鑒定。

5.誘導(dǎo)評估：顯微鏡下觀察成骨染色效果，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評估。誘導(dǎo)成功時，鈣質(zhì)結(jié)節(jié)會與茜素紅染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。

成脂誘導(dǎo)分化步驟

4.油紅O染色：取生理鹽水或1×PBS與油紅O原液配制油紅O工作液（油紅O原液: 生理鹽水=3:2），現(xiàn)用現(xiàn)配。向清洗干凈的誘導(dǎo)孔內(nèi)加入適量工作液，靜置染色30min；吸走油紅O工作液，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細(xì)胞干燥。

5.誘導(dǎo)評估：顯微鏡下觀察成脂染色效果，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評估；誘導(dǎo)成功時，脂滴會與油紅O染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。
 

成軟骨平面誘導(dǎo)分化步驟

1.將對數(shù)生長期的細(xì)胞消化下來計數(shù)，成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基細(xì)胞重懸細(xì)胞，離心后調(diào)整細(xì)胞密度密度1-2.0×107cells/mL。

成軟骨三維誘導(dǎo)分化步驟

3.染色鑒定
a)軟骨球固定：將軟骨球從離心管中轉(zhuǎn)移至EP管，并使用1×PBS清洗兩次，最后置于適量的4%中性甲醛溶液中。
b)石蠟包埋切片：軟骨球經(jīng)石蠟包埋后切片。
c)阿利辛藍(lán)染色：將石蠟切片脫蠟，使用阿利辛藍(lán)染液染色30min，用自來水流水沖洗2min，蒸餾水沖洗1次。
d)誘導(dǎo)評估：顯微鏡下觀察成軟骨染色效果，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評估。誘導(dǎo)成功時，軟骨組織中的內(nèi)酸性粘多糖可被阿利辛藍(lán)染成藍(lán)綠色。
NOTE: 間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化水平因細(xì)胞類型、細(xì)胞供體來源、培養(yǎng)條件、細(xì)胞代次、細(xì)胞狀態(tài)和分化時間等因素而異。