WB蛋白樣品制備常見問(wèn)題及解決方法

一直都在做蛋白研究，但是樣品制備中的小細(xì)節(jié)你都了解嗎？這里為大家整理了蛋白樣品制備中大大小小的常見問(wèn)題，一起來(lái)學(xué)習(xí)吧！

Q：貼壁細(xì)胞收集是刮下來(lái)好還是胰酶消化好？
A：兩種方式都是可行的，各有利弊。不必?fù)?dān)心刮刀收集會(huì)刮壞細(xì)胞，胰酶消化的程度掌握不好，也會(huì)讓細(xì)胞破損。胰酶消化可能會(huì)對(duì)某些膜蛋白產(chǎn)生影響，刮刀收集效率會(huì)略低，可根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇細(xì)胞收集的方式。做總蛋白提取時(shí)，可選擇直接在器皿中進(jìn)行裂解，無(wú)需提前收集。

PS：使用刮刀收集時(shí)，可加入PBS幫助收取細(xì)胞。

 

Q：所有WB實(shí)驗(yàn)都用總蛋白就可以完成嗎？
A：當(dāng)然不是，要根據(jù)WB的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定提取哪類蛋白，如需驗(yàn)證某些低豐度蛋白，或蛋白定位，或組分間表達(dá)量對(duì)比，則需要進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離或組分分離。

Q：用RIPA提取總蛋白為什么會(huì)有粘稠的不可溶沉淀？是什么？如何解決？
A：產(chǎn)生粘稠物的主要原因是RIPA不能將所有樣品全部裂解，產(chǎn)生的不可溶組分中主要含有核酸殘團(tuán)，細(xì)胞碎片（有些組織樣品還含有油脂），和部分蛋白，因此RIPA提取的僅僅是可溶性蛋白，并非真正的總蛋白。

解決方案：使用柱式法蛋白提取真正意義上的總蛋白

 

Q：不同時(shí)間點(diǎn)處理細(xì)胞，如何收集進(jìn)行蛋白提取更合理？
A：最好是收集完細(xì)胞后馬上進(jìn)行蛋白提取。

 

Q：濃度測(cè)定哪家強(qiáng)？
A：濃度測(cè)定方法很多，目前推薦使用兼容性較好的BCA法進(jìn)行濃度測(cè)定。

 

Q：蛋白樣品如何儲(chǔ)存？
A：蛋白樣品不建議久存，也不要反復(fù)凍融。下游做WB實(shí)驗(yàn)，建議蛋白濃度測(cè)定后，加入loading buffer煮樣，煮后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分裝成小管在-80℃，下次使用前拿出小管再次煮樣即可。

 

Q：樣品上樣前怎么處理？
A：蛋白濃度測(cè)定后，建議將各個(gè)樣品稀釋到某一固定濃度（稀釋可以PBS，水或裂解液），加入loading buffer后，在沸水中煮3-5分鐘，使蛋白充分變性，也可使用PCR儀95度加熱5分鐘。

PS：煮沸并非必須步驟，膜蛋白建議70℃或者更低溫度煮。

煮后在冰上靜置少許時(shí)間，進(jìn)行低速離心，即可上樣。

 

Q：組織樣品含血量多可以直接提蛋白嗎？
A：如組織樣品中含血較多，血紅蛋白可能會(huì)影響下游實(shí)驗(yàn)， 可以在組織樣品裂解前使用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行處理后，再進(jìn)行蛋白提取。