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單細胞+流式+多色免疫熒光聯(lián)合揭示麻風病的免疫抑制圖譜

瀏覽次數(shù):2222 發(fā)布日期:2022-6-22  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

文章題目:The immune-suppressive landscape in lepromatous leprosy revealed bysingle-cell RNA sequencing

發(fā)表時間:2022年1月

發(fā)表期刊:Cell Discovery(IF=10.849)

關鍵詞:麻風病,scRNA-seq,流式細胞分析,mIHC

研究對象:人皮膚活檢,人外周血

研究方法:單細胞測序+流式細胞分析+多色免疫熒光驗證

發(fā)表單位:山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)

麻風病是由麻風桿菌(Mlep)引起的一種慢性傳染病,主要病變在皮膚和周圍神經(jīng),可導致不可逆轉的殘疾和畸形。麻風病曾在全球廣泛流行數(shù)千年,即便是今天,全球每年新發(fā)現(xiàn)的病例數(shù)仍超過20萬,其中60%是瘤型麻風(L-LEP)。由于麻風病具有顯著的基因組保守性,一直被認為是一種有研究價值的疾病模型,可用于研究人類對細胞內(nèi)細菌免疫反應的調(diào)節(jié)。然而,Mlep對宿主免疫反應的調(diào)節(jié)以及促進Mlep增殖的L-LEP免疫妥協(xié)的分子機制尚未被充分闡明。在免疫研究領域中,越來越多的文章都采用了【單細胞測序技術+流式細胞分析技術+多色免疫熒光技術】“組合拳”的打法。本期推送為大家?guī)淼木褪遣捎眠@套“組合拳”開展麻風病免疫抑制研究的文章。

研究思路圖

· 文章摘要 ·

瘤型麻風(L-LEP)是由Mlep在巨噬細胞中大量增殖引起的,是研究細胞內(nèi)細菌逃避或調(diào)節(jié)宿主免疫反應分子機制的理想疾病模型。本研究對L-LEP患者和健康對照組的皮膚活檢和外周血單個核細胞(PBMC)分別進行了單細胞RNA測序,結果顯示在L-LEP病變中,表現(xiàn)出高表達水平LIPA的巨噬細胞亞群中APOE表達顯著上調(diào),與主要組織相容性復合體II基因HLA-DQB2MIF呈負相關,而MIF編碼一種促炎癥和抗微生物細胞因子。在L-LEP病變中,CD8+T細胞的耗竭表現(xiàn)為TIGITLAG3的高表達。此外,在L-LEP病變中觀察到抑制性免疫受體介導的皮膚免疫細胞間相互作用顯著增強。對于PBMC,HLA-DRhighFBP1high單核細胞亞群中,APOE的高表達水平和調(diào)節(jié)性T細胞的擴張被發(fā)現(xiàn)與L-LEP有關。這些發(fā)現(xiàn)揭示了L-LEP患者的主要抑制情況,為干預由細胞內(nèi)細菌引起的持續(xù)感染提供了潛在靶點。

· 研究結果 ·

scRNA-seq揭示皮膚免疫細胞組成

對5名L-LEP患者的病變皮膚和5名健康對照組(HC)的正常皮膚活檢樣本(共60,405個細胞)進行scRNA-seq,確定了包括T/自然殺傷(NK)細胞、B細胞和樹突狀細胞/巨噬細胞(DC/Mac)在內(nèi)的10種主要細胞類型(圖1)。進一步對DC/Mac細胞群和T/NK細胞群進行亞群分析,發(fā)現(xiàn)了多種細胞亞型,并對健康和疾病患者的細胞各類型細胞比例進行了比較。總之,研究確定了9種皮膚免疫細胞亞型,包括B細胞、CD4+T、CD8+T、NK、肥大細胞、朗格漢斯細胞、Mac_LIPA、Mac_FCN1和CD1C+DC(圖2)。

圖1 scRN-seq數(shù)據(jù)聚類顯示的主要皮膚細胞類型

 

圖2 皮膚DC/Mac和T/NK細胞群的亞群分析
 

具有免疫調(diào)節(jié)功能的APOE在L-LEP病變的Mac_LIPA中顯著上調(diào)

研究發(fā)現(xiàn),Mac_LIPA亞群表達了顯著高水平的APOE(圖3a)。對L-LEP患者和HC之間差異表達基因(DEG)的分析表明,APOE顯著上調(diào)(圖3b,c)。此外,在Mac_LIPA細胞中,APOE的表達與主要組織相容性復合體(MHC)II基因HLA-DQB2MIF的表達呈負相關,MIF編碼一種具有分枝桿菌控制功能的促炎癥細胞因子(圖3b,d)。在驗證隊列1中,bulkRNA-seq也顯示了L-LEP中APOE的顯著上調(diào)(圖3e)。mIHC實驗進一步證實了APOE在L-LEP病變(驗證隊列2)中的高表達及其與巨噬細胞標記物CD68的共定位(圖3f)。用Mlep感染人單核細胞源性巨噬細胞后,Mlep感染的巨噬細胞上清液中的ApoE蛋白濃度顯著高于未感染的巨噬細胞,尤其是在感染后48小時,這表明Mlep感染可誘導巨噬細胞上調(diào)ApoE的表達(圖3g)。
 
綜上所述, Mlep感染引起的APOE高表達與巨噬細胞中促炎癥和抗菌固有免疫反應受抑制之間存在相關性。

圖3 在L-LEP的Mac_LIPA中,具有免疫調(diào)節(jié)功能的APOE上調(diào)

L-LEP病變中的CD8+T細胞呈耗竭狀態(tài)

研究分析了T細胞中抑制性受體(耗竭標志物):PDCD1PD-1)、CTLA-4LAG3、TIGITHAVCR2TIM-3)的表達。與HC相比,在L-LEP病變中,所有五種耗竭標志物基因在CD4+和CD8+T細胞中的表達均有增加的趨勢(圖4a)。值得注意的是,在患者的CD8+T細胞中,觀察到TIGITLAG3顯著上調(diào)(圖4a,b),這意味著L-LEP病變中CD8+T細胞耗盡。而在CD4+T細胞中,在L-LEP和HC之間未觀察到這五種耗竭標記物的表達水平存在顯著差異(圖4a)。此外,驗證隊列1的bulkRNA-seq還表明,TIGITLAG3在L-LEP中顯著上調(diào)(圖4c)。驗證隊列2通過mIHC證實了與HC相比,TIGITLAG3的高表達以及TIGITLAG3與CD8+T細胞在L-LEP病變中的共定位(圖4d,e)。

圖4 L-LEP病變中的CD8+T細胞呈耗竭狀態(tài)

在L-LEP病變中,抑制性受體介導的皮膚免疫細胞之間的相互作用增強

分別對L-LEP患者和HC進行了皮膚免疫細胞的配體和受體相互作用分析。在L-LEP病變中,觀察到CTLA4/CD86、PDCD1(PD-1)/PDCD1LG2、LGALS9/HAVCR2(TIM-3)、PVR/TIGIT、TIGIT/NECTIN2和TIGIT/NECTIN3介導的相互作用顯著增強。CD8+T細胞和抗原呈遞細胞之間相互作用增強,在CTLA4/CD86、PDCD1/PDCD1LG2和TIGIT/NECTN2中最為明顯,這與CD8+T細胞的耗盡狀態(tài)一致。有趣的是,在HC中,PVR/TIGIT相互作用是由Mac_FCN1和T細胞介導的,而在L-LEP中,這種相互作用增強,并且僅在Mac_LIPA和T細胞之間出現(xiàn),這意味著Mac_LIPA在L-LEP中起著關鍵作用(圖5)?偟膩碚f,這些結果表明L-LEP病變中抑制性受體介導的相互作用與免疫抑制之間存在關聯(lián)。

圖5 抑制性受體介導的皮膚免疫細胞間的相互作用

  • L-LEP患者PBMC的免疫抑制譜

對7名L-LEP患者和6名HC的PBMC(共110477個細胞)進行scRNA-seq,確定了15個亞群(圖6)。

圖6 scRNA-seq數(shù)據(jù)聚類顯示PBMC組成

對髓樣細胞進行亞群發(fā)現(xiàn),APOE主要由Mono3(HLA-DRhighFBP1high)亞群表達(圖7b),且在L-LEP患者的該亞群中觀察到APOE顯著上調(diào)(圖8a)。通過流式細胞術實驗也在蛋白質水平上證實了該單核細胞亞群中APOE上調(diào)。通過ELISA實驗證實了L-LEP患者血清中的ApoE蛋白濃度也明顯高于HC(驗證隊列2)(圖8b)?紤]到APOE上述發(fā)現(xiàn),研究者認為單核細胞亞群Mono3(HLA-DRhighFBP1high)可能參與了Mlep感染的發(fā)病機制。

圖7 PBMC髓樣細胞亞群分析

在T細胞中,觀察到L-LEP患者的Treg(FOXP3+IL2RACD25+)深度擴張(圖8c)。進一步的流式細胞術實驗證實,患者PBMC中CD4+FOXP3+、CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞的比例均顯著高于HC(驗證隊列2)(圖8d-g)。分別對L-LEP患者和HC的PBMC亞群進行了配體和受體相互作用分析,發(fā)現(xiàn)Treg細胞與其他細胞類型的相互作用顯著增加(圖8h)?傊,HLA-DRhighFBP1high單核細胞亞群中APOE的高表達和Treg細胞的擴張可能有助于L-LEP患者PBMC的免疫抑制。

圖8 L-LEP患者HLA-DRhighFBP1high單核細胞亞群中APOE的上調(diào)和PBMC中Treg的擴增

· 文章總結 ·  

該研究通過【scRNA-seq+流式細胞術+mIHC】聯(lián)合研究策略,以單細胞分辨率展示了L-LEP的轉錄組學圖譜,揭示了疾病相關和免疫受損的單核細胞、T細胞和巨噬細胞亞群的免疫特征。這些細胞亞群及其各自具有免疫抑制功能的基因代表了預防和治療L-LEP和其他由細胞內(nèi)細菌引起的持續(xù)性傳染病的潛在靶點。

參考文獻:

Mi Z, Wang Z, Xue X, et al. The immune-suppressive landscape inlepromatous leprosy revealed by single-cell RNA sequencing. Cell Discov.2022;8(1):2. Published 2022 Jan 11. doi:10.1038/s41421-021-00353-3

來源:上海生物芯片有限公司
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