光纖記錄實驗中采集不到熒光信號的可能原因及實驗注意事項

 光纖記錄實驗操作較為簡便，能夠長時間穩(wěn)定的動態(tài)檢測動物的神經(jīng)信號，目前在神經(jīng)科學(xué)研究中應(yīng)用越發(fā)廣泛。但是在做光纖記錄實驗中，有時會遇到采集不到熒光信號的情況，各位小伙伴是否也曾遇到過？今天，小沃帶大家梳理一遍采集不到信號的可能原因及實驗注意事項，助你實驗更順暢！

01病毒
1.病毒是否存在反復(fù)凍融現(xiàn)象，反復(fù)凍融會降低病毒滴度，從而影響病毒轉(zhuǎn)染效率。因此光纖記錄實驗中，病毒應(yīng)即拿即用，避免凍融。

2.病毒與目標(biāo)腦區(qū)神經(jīng)元特異性結(jié)合程度也會影響熒光信號。

02病毒注射
1.手術(shù)前定位：通過預(yù)實驗對腦區(qū)精準(zhǔn)定位（可通過臺盼藍注射定位）。在病毒注射前，我們可以先注射臺盼藍進行預(yù)實驗以達到練手的目的，提高后面實驗的成功率。

腦區(qū)坐標(biāo)定位參考：調(diào)平時注意左右高度差小于0.03mm。
 

2.病毒注射：選擇較細(xì)直徑的玻璃電極可以減少注射損傷，對于淺層腦區(qū)注射，可減少病毒泄露。病毒注射后留針10min。
 

3.病毒注射檢測：切腦片看熒光表達。
熒光染色實驗拍不出帶有熒光的細(xì)胞，可能原因是顯微鏡聚焦未在神經(jīng)細(xì)胞這一層上（如上圖出現(xiàn)模糊團狀，可能會是細(xì)胞）、注射的腦區(qū)與病毒反應(yīng)的特異性神經(jīng)元數(shù)量太少、或是熒光淬滅掉了。
 

注意事項：
如果病毒沒注射成功，可能原因有手術(shù)中腦區(qū)定位有偏差導(dǎo)致病毒注射位置不對（目標(biāo)腦區(qū)很小的話會常存在這個問題）、病毒注射后順著腦室流走、病毒注射后未留針導(dǎo)致病毒順著注射孔被析出。

03陶瓷插針埋植位置

1.病毒注射與陶瓷插針植入可以在同一個手術(shù)進行，避免二次手術(shù)對小鼠造成傷害；

2.選擇合適的夾持器，滿足不同深度及相對距離的植入手術(shù)；

3.定期查看定位儀操作臂與夾持器的固定情況，防止角度偏差。

病毒注射表達區(qū)域與陶瓷插針的植入位置需要保持接近，根據(jù)文獻中數(shù)據(jù)，超過100µm就會明顯影響信號強度。

HanQin et al., Neurophoton,2019

 

04耗材參數(shù)搭配
1.光纖記錄實驗對環(huán)境光比較敏感，建議實驗在光線相對穩(wěn)定、昏暗的環(huán)境下進行。光纖記錄更適合選擇黑色陶瓷插針與黑色陶瓷套管，可避免環(huán)境光對熒光信號的影響；

2.較大數(shù)值孔徑的耗材有助于熒光信號的傳輸，所有的配件耗材保持相同的芯徑、NA數(shù)值更有助于實驗記錄；
 

3.使用高強度的激光器對光纖進行漂白，使得光纖等耗材的自發(fā)熒光降低，減少噪聲干擾。
 

光纖漂白器

 

05光纖記錄參數(shù)設(shè)置
1.首先檢查線路連接：包括光纖與機器連接的端口，光纖與小鼠連接的端口（并使用酒精擦拭光纖端口和鏡頭）。
 

2.調(diào)高曝光時間：Cmos相機拍攝時間增加，有助于采集到熒光信號。
 

 

注意事項：

1.若未記錄到信號，可適當(dāng)調(diào)高光源功率；

2.動物腦區(qū)較大，病毒注射量可適量增加；

3.病毒注射后也可先不埋植插針，待2-3周后病毒表達，陶瓷插針連接光纖一起植入，邊植入插針邊檢測鈣信號。

 

瑞沃德三色多通道光纖記錄系統(tǒng)

產(chǎn)品特點：

• 最大支持9通道同時采集，滿足多只動物或多個腦區(qū)位點同時實驗；

• 高靈敏雙檢測器，獨立分時序采集，避免熒光串?dāng)_；

• 專業(yè)集成信號采集、數(shù)據(jù)分析、行為學(xué)采集分析模塊；

• 輸出信號參數(shù)自定義調(diào)節(jié)，可進行多種觸發(fā)，實現(xiàn)刺激和記錄的閉環(huán)控制；

• 兼容光遺傳學(xué)，實現(xiàn)同一位點記錄和刺激。