文獻解讀：脊髓神經元調控傷害性熱刺激感受新機制
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文獻精讀第25期
對人來說，皮膚溫度高于43℃會引起急性疼痛，長時間暴露于傷害性熱刺激中會造成組織損傷，并破壞體溫的動態(tài)平衡。脊髓背角神經元在處理和傳遞來自背根神經節(jié)（Dorsal Root Ganglion, DRG）痛覺傳入纖維的感覺信號中起著關鍵作用，但是，傷害性熱刺激信號在脊髓中的處理過程尚不清楚。2022年5月12日，美國凱斯西儲大學醫(yī)學院的研究人員在《Neuron》雜志上發(fā)表題為“A novel spinal neuron connection for heat sensation”的文章，該研究證實了由脊髓ErbB4+（ErbB4，一種表皮生長因子受體家族的酪氨酸激酶受體）神經元能夠通過NRG1-ErbB4信號通路來調控機體對傷害性熱刺激的感受，揭示了脊髓中一個新的傷害性熱刺激感受的調控機制。
核心觀點
1、脊髓ErbB4+神經元能夠被傷害性熱刺激所激活；
2、脊髓ErbB4+神經元受TRPV1+傷害感受器的單突觸神經支配；
3、消融或抑制ErbB4+神經元會降低動物對傷害性熱刺激的感受；
4、同時抑制脊髓中ErbB4+、SST+和CCK+神經元能夠進一步降低傷害性熱刺激的感受；
5、NRG1-ErbB4信號通路能夠促進傷害性熱刺激的感受和熱痛過敏反應。
研究結果分析
1. 傷害性熱刺激能夠激活脊髓中ErbB4+興奮性神經元
為了識別對傷害性熱刺激產生反應的神經元，作者利用了EGFP表達依賴于內源性cFos啟動子的cFos::shEGFP小鼠。當cFos::shEGFP小鼠受到傷害性熱刺激（52℃熱板）時，脊髓背角神經元中的shEGFP表達增加，大量的shEGFP+神經元位于脊髓背角表層（Ⅰ~Ⅱ層），這是傷害性感覺信息的接收區(qū)域。單細胞RT-PCR結果顯示，78%的shEGFP+神經元為興奮性神經元（Vglut2+），22%的shEGFP+神經元為GABA能神經元（GAD65/67+）。這與之前的研究結果一致，即大多數(shù)對傷害性熱刺激產生反應的神經元是興奮性神經元。然而，shEGFP+神經元具有極高的異質性，涉及到多種類型的神經元，比如，其中膽囊收縮素陽性（Cholecystokinin+, CCK+）和生長激素抑制素陽性（Somatostatin+, SST+）神經元分別占18%和14%。值得注意的是，~1/3的shEGFP+神經元表達了ErbB4，而ErbB4主要表達于興奮性神經元中。
這些結果表明，傷害性熱刺激能夠激活一群ErbB4+興奮性神經元。為了驗證這一假設，作者對ErbB4:: CreER;Ai9小鼠進行熱刺激，該小鼠tdTomato的表達依賴于內源性的ErbB4啟動子。在脊髓中，ErbB4-tdT+神經元主要集中在背角，分布于多層背角和脊髓外側核（Lateral Spinal Nucleus, LSN）中，然而，熱激活的ErbB4-tdT神經元（cFos+）主要位于脊髓背角表層中。ErbB4-tdT神經元約占cFos+神經元的33%。這些結果確認了脊髓背角表層ErbB4+興奮性神經元是一種新型的傷害性熱反應細胞。
2. 脊髓ErbB4+，SST+和CCK+神經元負責傷害性熱刺激感受
接下來，作者通過在ErbB4::CreER;LSL-EYFP（ErbB4-EYFP）小鼠椎管內注射AAV-mCherry-DIO-dtA（AAV-dtA）病毒，在ErbB4+細胞中特異性的表達A型白喉毒素（diphtheria toxin subunit A, dtA）來消融脊髓中的ErbB4+神經元。與注射對照病毒的小鼠相比，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠中EYFP+細胞和Nmur2+神經元數(shù)目顯著減少。接下來，小鼠接受了一系列的行為測試。與對照小鼠相比，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠在熱板以及哈格里夫斯實驗中，后爪退縮和舔爪的潛伏期中增加了~40%，表明ErbB4+神經元對傷害性熱刺激的感受至關重要。辣椒素能夠激活感覺神經元中的TRPV1受體，誘發(fā)自發(fā)性疼痛，與對照組相比，在AAV-dtA注射的ErbB4-EYFP小鼠，辣椒素誘導的小鼠舔足次數(shù)減少了30%。這些結果表明，ErbB4+神經元是傷害性熱刺激的感受所必需的。此外，注射AAV-dtA的ErbB4-EYFP小鼠對機械刺激、冰冷-溫熱、以及癢刺激的反應與對照類似。這表明脊髓ErbB4+神經元可能不參與這些刺激的感受。
除了ErbB4+神經元，SST+和CCK+中間神經元也會被傷害性熱刺激激活。為了確定它們對熱刺激感受的貢獻，作者分別消融了這些神經元。在熱板以及哈格里夫斯實驗中，消融SST+神經元后小鼠的反應潛伏期分別增加了26%和22%，而消融CCK+神經元的反應潛伏期則沒有增加。值得注意的是，將ErbB4+、SST+和CCK+三類神經元同時消融時，小鼠對傷害性熱刺激感受的抑制作用顯著增加到60% - 80%。這些結果表明，傷害性熱刺激感受涉及脊髓中的ErbB4+、SST+和CCK+神經元。
3. ErbB4+神經元受TRPV1+痛覺感受器的單突觸神經支配，且能被傷害性熱刺激而非機械刺激所激活
不同的軀體感覺信息由不同類型的傳入纖維傳入脊髓背角：Aβ纖維主要用于傳遞非傷害性刺激，而Aδ和C纖維用于傳遞傷害性刺激。為了確定ErbB4+神經元的信息來源，作者利用帶背根的縱向脊髓切片來記錄背角中ErbB4+神經元的興奮性突觸后電流（EPSCs）。對于Aδ和C纖維的刺激傳入，分別有76%和54%的表層ErbB4+神經元記錄到了EPSCs，其中67%和46%的ErbB4+神經元為單突觸傳入。相比之下，表層中有25%的ErbB4+神經元記錄到Aβ纖維信息傳入，只有9.1%是單突觸傳入。此外，在深層ErbB4+神經元中，6.7%和5.6%的神經元接受Aδ和C纖維的單突觸傳入。這些結果表明，淺表層的ErbB4+神經元主要接受攜帶傷害性信息的C和Aδ纖維的單突觸傳入。
為了驗證ErbB4+神經元是否被TRPV1+傷害性感受器的突觸支配，作者用到了QX-314（一種細胞內鈉通道抑制劑，其細胞進入依賴于TRPV1的激活）。單獨使用QX-314對C纖維傳入的ErbB4+神經元EPSC振幅影響不大。然而，在TRPV1激活物辣椒素存在的情況下，QX-314使EPSCs減弱，表明ErbB4+神經元接受TRPV1+纖維的支配。與之一致的是，在QX-314和辣椒素的存在下，對C纖維刺激有反應的ErbB4+神經元的數(shù)量減少了。這種作用是C纖維特異性的，因為A纖維中TRPV1表達較低，QX-314對刺激A纖維產生的EPSCs的影響不大。這些結果為表層ErbB4+神經元受TRPV1+ C纖維的支配提供了藥理學依據(jù)。為了找到這種神經支配的形態(tài)學證據(jù)，作者將AAV-DIO-mCherry注射到TRPV1::Cre;ErbB4::CreER小鼠脊髓腰膨大區(qū)標記ErbB4+神經元，并將AAV-DIO-ChR2-EYFP注射到DRG中標記TRPV1+末端。脊髓切片用突觸后標記物Homer進行染色標記�？梢钥吹紼rbB4+神經元（mCherry+）被TRPV1+末端（即EYFP+）包圍。TRPV1+末端與Homer+突觸以及ErbB4+細胞密切相關。這些結果進一步表明，脊髓背角表層ErbB4+神經元受到DRG中TRPV1+ 傳入纖維的支配。
為了證明這些突觸是有功能的，作者利用光遺傳學激活表達視蛋白ChR2的TRPV1+末端。42%的表層ErbB4+神經元能夠在光刺激下誘發(fā)EPSCs，這些EPSCs被TTX所抑制，而在TTX和4-AP同時存在的情況下，仍有36%的ErbB4+表層神經元能夠被光刺激誘發(fā)EPSCs，這表明它們是由DRG中TRPV1+傳入纖維的單突觸所支配的。綜上所述，脊髓背角表層ErbB4+神經元直接受TRPV1+傷害性感受器的單突觸神經支配。
為了確定ErbB4+神經元是否對機械刺激產生反應，作者將AAV-DIO-ChR2-EYFP注射到MrgprD::CreER;ErbB4::CreER小鼠DRG中，讓傳導機械刺激的MrgprD+神經元表達ChR2，同時將AAV-DIO-mCherry注射到腰膨大來標記ErbB4+神經元。然而，對脊髓切片進行光刺激，大多數(shù)的ErbB4+神經元（87%）未能記錄到EPSCs，這表明大多數(shù)ErbB4+神經元不接受來自機械刺激感覺神經元的傳入。在3個響應ErbB4+神經元中，有2個被TTX和4-AP抑制，表明它們接受了多級突觸傳導，只有一個出現(xiàn)了4-AP增強的EPSCs，表明其受到機械感覺神經元的單突觸支配。作為對照，作者采用了相同的策略來觀察SST+脊髓神經元對機械感覺神經元刺激的反應。大多數(shù)記錄的SST+神經元（72%）產生了光刺激誘導的EPSCs，表明它們接受MrgprD+機械感覺神經元的傳入，且61%為單突觸支配。這些結果表明，脊髓背角表層ErbB4+神經元主要受傷害性熱刺激感受神經元的支配，而非機械刺激感覺神經元的支配。
為了進一步表征在更接近生理條件下ErbB4+神經元的敏感性，作者構建了半完整的離體檢測范式，通過分離相連的部分脊髓、腰椎根、DRG、隱神經和后肢皮膚，來記錄脊髓ErbB4+神經元對皮膚刺激的反應。在記錄的16個ErbB4+神經元中，有9個（56%）對52℃刺激有反應，有5個（30%）對0℃刺激有反應。對15℃和40℃刺激有反應的神經元分別為1個（7%）和2個（13%）。這些結果表明，表層ErbB4+神經元對傷害性熱刺激的反應較好，其次是冰冷刺激，而對涼或溫熱刺激的反應較弱。為了確定ErbB4+神經元是否對機械刺激有反應，研究者用Von-Frey絲刺激皮膚。在16個記錄的神經元中，有14個無反應。這些結果表明，脊髓背角表層ErbB4+神經元對傷害性熱刺激比機械刺激更敏感。
4.抑制ErbB4+神經元會減弱動物對傷害性熱刺激的感受，反之則增強動物對熱刺激的感受
隨后，作者探討了脊髓ErbB4+神經元活性對傷害性熱刺激感受的影響。為了降低ErbB4+神經元的活性，作者將AAV-DIO-hM4Di-mCherry（AAV-hM4Di）注射到ErbB4::CreER小鼠的脊髓腰膨大，并通過CNO來抑制ErbB4+神經元活性。與對照相比，抑制ErbB4+神經元增加了小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應潛伏期，并減少了辣椒素誘導的舔足。抑制SST+而非CCK+神經元，小鼠在熱板以及哈格里夫斯實驗中的反應潛伏期增加，但對辣椒素誘導的舔足沒有影響。值得注意的是，當這三類的神經元活性同時降低時，小鼠對傷害性熱刺激感受的抑制效果增加60%~80%。這些結果表明脊髓ErbB4+、SST+和CCK+神經元的活動共同參與傷害性熱刺激感受，支持群體編碼模式理論。
為了增加脊髓ErbB4+神經元的活性，作者將AAV-DIO-hM3Dq-mCherry注射到ErbB4::CreER小鼠的脊髓腰膨大。與對照相比，激活ErbB4+神經元降低了小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應潛伏期，且增加了辣椒素誘導的持續(xù)舔足時間。表明， ErbB4+神經元激活增強了動物對傷害性熱刺激的感受。總之，這些結果揭示了ErbB4+神經元在傷害性熱刺激感受中的關鍵作用。
5. 傷害性熱刺激的感受依賴ErbB4激酶的活性
ErbB4由生長因子神經調節(jié)蛋白1（Neuregulin 1, NRG1）所激活，為了檢測NRG1-ErbB4信號通路是否參與了傷害性熱感受，作者檢測了脊髓背角NRG1和pErbB4的表達。結果顯示，暴露于52℃熱板的小鼠其脊髓背角NRG1和pErbB4的表達增加，表明傷害性熱刺激可以增強脊髓背角的NRG1-ErbB4信號。接下來，作者評估了 ErbB4的存在對傷害性熱刺激的感受是否必要，為此，作者構建了ErbB4-rKO小鼠（該小鼠在除心臟外的任何組織，包括脊髓中都不表達ErbB4）。值得注意的是，與對照組小鼠相比，ErbB4-rKO小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應潛伏期增加，且辣椒素誘導的舔足次數(shù)減少，表明ErbB4在這些反應中發(fā)揮了作用。隨后，為了消除其它組織中ErbB4突變可能存在的影響，作者通過在ErbB4f/f小鼠脊髓腰膨大注射了AAV-Cre-GFP病毒，來特異性的敲除脊髓背角中的ErbB4。與對照組相比，脊髓背角ErbB4敲除使得小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應潛伏期增加，辣椒素誘導的舔足次數(shù)減少。這些結果揭示了ErbB4在傷害性熱刺激感受中的必要作用。
為了確定熱感受是否涉及ErbB4的激酶活性激活，作者以鞘內注射的方式給小鼠注射阿法替尼（一種ErbB激酶抑制劑）。阿法替尼顯著減少了脊髓腰膨大中pErbB4的表達。動物在熱板、哈格里夫斯和辣椒素實驗中的反應也減弱，但對針刺、掐和Von-Frey絲刺激反應的影響不大。這些結果提示ErbB4激酶活性與傷害性熱刺激感受有關。為了進一步驗證這一點，作者對敲入突變株的T796G小鼠進行了研究，在T796G小鼠中，ErbB4可以被體積較大的抑制劑1NMPP1特異性抑制。鞘內注射1NMPP1可降低脊髓腰膨大中pErbB4的表達。在行為反應測試中，1NMPP1顯示了類似阿法替尼的效果。總之，這些結果表明脊髓中ErbB4的激酶活性與傷害性熱刺激感受有關。
6. DRG中的NRG1參與了傷害性熱刺激的感受
為了確定傷害性熱刺激感受是否與內源性NRG1有關，小鼠被注射了ecto-ErbB4（一種NRG1中和肽）。鞘內注射ecto-ErbB4可減少脊髓中的pErbB4表達，并且增加小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應潛伏期，減少辣椒素引起的舔足，但不會影響對針刺、掐和Von-Frey刺激的反應。這些結果表明，內源性NRG1參與了傷害性熱刺激的感受。
NRG1在DRG中大量表達，為了確定DRG神經元中的NRG1是否參與熱感覺，作者構建了advillin-CreER;NRG1f/f小鼠，通過給予他莫西芬，可以誘導小鼠感覺性神經節(jié)中NRG1的條件性敲除（cKO）。與對照相比，cKO小鼠脊髓中的NRG1和pErbB4蛋白的表達均減少，NRG1 mRNA的水平在DRG中降低，但在脊髓中沒有顯著變化。cKO小鼠在熱板和哈格里夫斯實驗中的反應潛伏期增加，在辣椒素實驗中的舔足次數(shù)減少。然而，脊髓中的NRG1敲低對熱刺激行為反應或背角中的pErbB4幾乎沒有影響。這些結果表明DRG中的NRG1信號在傷害性熱刺激的感受中起作用。
7. NRG1-ErbB4信號能夠調控ErbB4+神經元谷氨酸的傳遞
上述結果已經證明，表層中c-Fos+ ErbB4+神經元大部分是興奮性神經元。為了確定NRG1和ErbB4是否能夠調節(jié)谷氨酸的傳遞，作者將AAV-DIO-ChR2-EYFP病毒注射到ErbB4::CreER;Ai9小鼠中，在ErbB4+神經元中特異性表達ChR2。在脊髓切片中，通過光刺激激活這些表達ChR2的ErbB4+神經元，并在其鄰近的ErbB4-神經元中記錄突觸后電流（PSCs）。在記錄的112 個ErbB4-神經元中，當膜電位鉗制在-70 mV時，其中31個神經元記錄到了光刺激誘發(fā)的內向電流；當膜電位為0 mV時，所有神經元均未記錄到光刺激誘發(fā)的外向電流，表明這些電流是EPSCs，而不是IPSCs。這些結果表明，表層的ErbB4+神經元通過谷氨酸傳遞與下游神經元進行交流。事實上，這些EPSCs能夠被AMPA受體和NMDA受體抑制劑CNQX和AP-5阻斷。根據(jù)這些EPSCs對TTX和4-AP的潛伏期和阻抗，可以確定，半數(shù)下游神經元接受ErbB4+神經元的單突觸神經支配。用生物素標記這些記錄神經元的形態(tài)特征也支持這一觀點。
接下來，作者確定了ErbB4+神經元和靶細胞之間的谷氨酸傳遞是否受到NRG1-ErbB4信號通路的調控。在給予NRG1后的15分鐘內，光刺激誘發(fā)的EPSCs的波幅顯著增加，而這種作用在洗脫后減弱，表明NRG1促進谷氨酸傳遞。此外，給予ErbB4抑制劑阿法替尼降低了EPSC幅值，表明ErbB4激酶活性的參與谷氨酸傳遞。總之，這些數(shù)據(jù)證明了NRG1-ErbB4信號通路在脊髓谷氨酸傳遞中的作用。
8. NRG1-ErbB4信號通路參與病理性的熱痛過敏
在周圍神經炎癥或損傷等病理條件下，機體對熱刺激的反應更加敏感。在完全弗氏佐劑（Complete Freund’s Adjuvant, CFA）引起炎癥性疼痛模型中，小鼠患肢在哈格里夫斯實驗中的反應潛伏期顯著降低。以下證據(jù)能夠表明NRG1-ErbB4信號通路在炎癥引起的熱痛過敏中起作用。首先，NRG1和pErbB4在CFA注射小鼠的同側脊髓腰膨大中的表達增加。第二，在哈格里夫斯實驗中，鞘內中和NRG1能夠增加小鼠撤足的潛伏期。第三，阿法替尼能夠抑制野生型小鼠的熱痛過敏，1NMPP1能夠抑制T796G小鼠的熱痛過敏。
此外，作者還研究了該通路在慢性壓迫性損傷（Chronic Constriction Injury, CCI）誘導的熱痛過敏反應中的潛在作用。CCI能夠誘導小鼠在哈格里夫斯實驗中的反應潛伏期降低，提示發(fā)生熱痛過敏。與假手術小鼠相比，CCI組小鼠同側腰膨大中NRG1和pErbB4的表達升高。野生型鞘內給予ecto-ErbB4、阿法替尼、或T796G小鼠給予1NMPP1均可降低CCI引起的熱痛過敏。這些結果支持NRG1-ErbB4信號通路參與病理性的熱過敏的觀點。
總結
該研究通過分析熱刺激感受神經元，識別出脊髓背角表層ErbB4在傷害性熱刺激的感受中發(fā)揮了關鍵作用。這些ErbB4+神經元顯示以下特性。首先，它們主要接收來自攜帶傷害性信息的Aδ和C纖維的單突觸傳入，而不是接受來自攜帶非傷害性信息的Aβ纖維傳入。其次，ErbB4+神經元受DRG中TRPV1+傷害性傳入纖維的單突觸支配，對傷害性熱刺激反應較好，而對機械刺激反應較差。第三，消融或抑制ErbB4+神經元減弱了動物在熱板、哈格里夫斯以及辣椒素實驗中的反應，表明它們的活動與傷害性熱刺激的感受有關。最后，文章證明了NRG1-ErbB4信號通路在生理條件下的傷害性熱刺激感受和病理條件下的熱痛過敏反應中的作用。
亮點研究方法
這項工作闡述了脊髓ErbB4+神經元在傷害性熱刺激感受中的作用機制。研究用到了動物手術造模、行為學評估、光遺傳學、電生理記錄、組織病理檢測、給藥以及分子檢測等實驗技術。瑞沃德深耕生命科學研究領域20年，一直致力于為客戶提供可信賴的解決方案和服務，可提供該研究中涉及的動物手術造模、行為學評估、光遺傳學、電生理記錄、組織病理檢測、給藥以及分子檢測等實驗的完整解決方案。截至目前，瑞沃德產品及服務覆蓋海內外 100 多個國家和地區(qū)，客戶涵蓋全球700+醫(yī)院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全球科研人員發(fā)表SCI文章12000+，獲得行業(yè)廣泛認可。
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https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.04.021
