小鼠觸屏行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法非匹配實(shí)驗(yàn)（TUNL）講解

背景
十年來，觸屏法已成為一種高效、有效的嚙齒動(dòng)物診斷方法。目前，觸摸屏已廣泛應(yīng)用于認(rèn)知測(cè)試和轉(zhuǎn)化研究中嚙齒類動(dòng)物模型的治療篩選。它允許行為、損傷和藥理學(xué)研究。

組成部分
觸屏室由一個(gè)帶有紅外框架的屏幕和一個(gè)帶有獎(jiǎng)勵(lì)系統(tǒng)的斯金納箱組成。
MED Associates Touchscreen 軟件Klimbic
  試驗(yàn)獨(dú)特的非匹配測(cè)定（TUNL）是一種觸摸屏操作性調(diào)節(jié)程序，允許同時(shí)定量小鼠和大鼠的工作記憶和模式分離。在本研究中，我們使用TUNL測(cè)定來量化C57BL / 6J和DBA / 2J小鼠的這些認(rèn)知能力。在TUNL測(cè)試階段，會(huì)在7x3（5x3，10x5等）的矩陣中隨機(jī)出現(xiàn)一個(gè)提示圖案，持續(xù)若干秒，隨后在一定的延遲時(shí)間后，隨機(jī)在兩個(gè)位置出現(xiàn)圖案，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需要觸碰與提示圖案非匹配位置的圖案才可獲取獎(jiǎng)勵(lì)。

• 在試驗(yàn)前，雄性C57BL / 6J小鼠在它們?cè)?0-18周齡時(shí)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，此時(shí)它們被單獨(dú)安置。老鼠可以自由取水，但被控制進(jìn)食（體重保持在基準(zhǔn)體重的85%~95%）。，溫度受控的環(huán)境（21±1°C）中，以12：12的光：暗循環(huán)。
• 環(huán)境適應(yīng)訓(xùn)練階段:小鼠必須記住呈現(xiàn)出來的的刺激圖像（1個(gè)白色方塊刺激），并且進(jìn)行選擇，當(dāng)小鼠準(zhǔn)確觸到白色刺激區(qū)域，使之從屏幕消失（此階段刺激出現(xiàn)后為無限時(shí)間，小鼠不觸便不會(huì)消失），小鼠可獲得1顆圓粒食物獎(jiǎng)勵(lì)，隨后屏幕自動(dòng)呈現(xiàn)下一次刺激在此期間，給食器的凹槽處常亮起黃燈（以提示獎(jiǎng)勵(lì)出現(xiàn)的位置），該位置的記憶被量化。
• 樣品訓(xùn)練階段：​當(dāng)小鼠在1h內(nèi)準(zhǔn)確觸碰屏幕后獲得至少30次獎(jiǎng)勵(lì)，便可進(jìn)入樣品訓(xùn)練階段：小鼠需要選擇黑色觸屏背景上顯示的白色刺激，位于行和列矩陣中隨機(jī)顯示的位置。小鼠必須對(duì)刺激物進(jìn)行鼻戳，使之從屏幕上消失。隨后是持續(xù)時(shí)間的短暫延遲（這段時(shí)間是可變可控的），通常以秒為單位，刺激出現(xiàn)后，小鼠若不觸碰屏幕，20秒后刺激自動(dòng)消失。當(dāng)小鼠觸碰刺激區(qū)域，就會(huì)判定為正確，將會(huì)獲得1顆圓粒獎(jiǎng)勵(lì)，（此階段給食器凹槽處只會(huì)在選擇正確后亮燈提示）。啟動(dòng)下一輪刺激需要小鼠將鼻子探入給食器的凹槽處才可觸發(fā)。
• TUNL測(cè)試階段​：當(dāng)小鼠在1h內(nèi)獲得至少30次獎(jiǎng)勵(lì)，便可進(jìn)入TUNL測(cè)試階段，在觸摸屏上呈現(xiàn)的2個(gè)白色刺激：先前呈現(xiàn)的樣本刺激和在矩陣中隨機(jī)選擇的位置呈現(xiàn)的新刺激。小鼠必須嗅探新的刺激（即在樣品階段未出現(xiàn)的刺激）才能獲得1顆圓粒食物獎(jiǎng)勵(lì)。在每次試驗(yàn)中，兩個(gè)刺激間的延遲為2秒。若先前呈現(xiàn)的樣本刺激10秒內(nèi)小鼠并未觸碰，則判定為missed，不會(huì)再出現(xiàn)新的刺激，依舊從前線呈現(xiàn)的樣本刺激開始。當(dāng)小鼠對(duì)于2秒延遲學(xué)習(xí)和完成度達(dá)標(biāo)后，可繼續(xù)增加實(shí)驗(yàn)難度，在實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)出現(xiàn)2s，4s以及8s延遲，通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行操縱以探測(cè)工作記憶，并且通過實(shí)驗(yàn)操縱樣品刺激和新型刺激之間的距離可以探測(cè)模式分離。
• 在TUNL測(cè)試期間，每次試驗(yàn)都從室燈和刺激燈的照明開始。當(dāng)小鼠對(duì)位于刺激燈正下方的食物容器進(jìn)行鼻戳?xí)r，刺激光熄滅，樣本刺激隨機(jī)呈現(xiàn)在觸摸屏上5×3矩陣中的十個(gè)位置之一。當(dāng)老鼠對(duì)刺激物進(jìn)行鼻戳?xí)r，它立即從屏幕上消失。在此之后，發(fā)生了3個(gè)延遲之一（5，10，15 s）。在延遲期間，室燈亮起，后部刺激燈熄滅，觸摸屏上不顯示任何內(nèi)容。延遲是在每項(xiàng)試驗(yàn)中隨機(jī)選擇的。在延遲結(jié)束時(shí)，后部刺激燈被照亮，以指示可以通過對(duì)食物容器的鼻子戳來啟動(dòng)選擇階段。當(dāng)小鼠對(duì)食物容器進(jìn)行鼻戳?xí)r，刺激光熄滅，選擇階段開始。在選擇階段，屏幕上同時(shí)呈現(xiàn)兩個(gè)刺激。首先是樣本刺激（不正確的選擇），它呈現(xiàn)在與樣品階段呈現(xiàn)相同的位置。第二種是新穎的刺激（正確的選擇），它在觸摸屏上的5×3矩陣中的隨機(jī)位置呈現(xiàn)。樣本刺激和新型刺激之間的水平距離和垂直距離，在每次試驗(yàn)中隨機(jī)且獨(dú)立地變化。如果小鼠在選擇階段對(duì)正確的刺激進(jìn)行嗅探，則通過給食器獎(jiǎng)勵(lì)1顆圓粒食物。如果小鼠在選擇階段對(duì)不正確的刺激進(jìn)行嗅探，則通過熄滅室燈10秒來提供超時(shí)。獎(jiǎng)勵(lì)或超時(shí)后有5秒鐘的試驗(yàn)間隔。下一次試驗(yàn)在試驗(yàn)間隔之后開始。
• 如果有需要，可添加校正試驗(yàn)用于TUNL試驗(yàn)。具體來說，如果在試驗(yàn)的選擇階段做出了錯(cuò)誤的選擇，那么在下一次試驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)相同的刺激模式。這一直持續(xù)到鼠標(biāo)在選擇階段做出正確的選擇。采用這種策略是為了避免鼠標(biāo)產(chǎn)生難以解決的側(cè)偏，即所有選擇都指向右側(cè)或左側(cè)。在KLIMBIC圖像設(shè)置界面可以進(jìn)行連續(xù)呈現(xiàn)相同圖像的設(shè)置。為了確保小鼠在TUNL測(cè)試期間處于“任務(wù)”狀態(tài)，在（1）呈現(xiàn)樣本刺激，（2）點(diǎn)亮刺激燈以指示可以啟動(dòng)選擇階段，以及（3）在選擇階段呈現(xiàn)刺激后，使用15秒中間保持。具體來說，在試驗(yàn)過程中的每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，如果小鼠未能在15秒內(nèi)用鼻子捅屏幕上的刺激物或通過用鼻子捅食物容器啟動(dòng)選擇階段，則試驗(yàn)終止。當(dāng)小鼠完成64個(gè)試驗(yàn)（不包括遺漏的試驗(yàn)）或60分鐘后（以先發(fā)生的為準(zhǔn)）終止試驗(yàn)。

​實(shí)驗(yàn)分析：
分析因素包括樣提示圖像和選擇期之間的延遲（0、5、10、15秒）、選擇期兩個(gè)圖像之間的水平距離（1、2、3；從兩個(gè)圖像的最小距離到最大距離排序）和選擇期圖像之間的垂直距離（1、2；從兩個(gè)圖像之間的最小距離到最大距離排序）。此后，這些變量分別縮寫為延遲、水平距離和垂直距離。水平距離和垂直距離類別中兩個(gè)選擇圖像的相對(duì)位置。

• C57BL/6J小鼠和DBA/2J小鼠完成訓(xùn)練階段所需的訓(xùn)練次數(shù)沒有顯著差異
• C57BL/6J小鼠在0、5和10秒延遲時(shí)的正確率顯著高于DBA/2J小鼠（圖3a）。C57BL/6J小鼠和DBA/2J小鼠的表現(xiàn)在15秒延遲上沒有顯著差異。C57BL/6J和DBA/2J小鼠之間的最大差異是0秒延遲，在此期間，工作記憶對(duì)性能的影響可以忽略不計(jì)。
•  C57BL/6J小鼠和DBA/2J小鼠在最容易辨別時(shí)的表現(xiàn)沒有差異，在此期間，兩個(gè)選擇相刺激以最寬的距離顯示。相反，與C57BL/6J小鼠相比，DBA/2J小鼠在更困難的辨別上的表現(xiàn)明顯受損

• 當(dāng)選擇相刺激出現(xiàn)在最寬的水平距離時(shí)，C57BL/6J小鼠和DBA/2J小鼠的性能在所有延遲都是等效的（a，d）。相反，當(dāng)選擇相刺激呈現(xiàn)在中間水平距離（b，e）和狹窄水平距離（c，f）時(shí)，DBA/2J小鼠的性能相對(duì)于C57BL/6J小鼠顯著受損。這種性能損害在多個(gè)延遲時(shí)觀察到，最一致的是在0秒延遲時(shí)，當(dāng)模式分離而不是工作記憶預(yù)期可以解釋性能變化時(shí)。無論選擇相刺激之間的垂直距離如何，都可以觀察到這種水平分離缺陷（a與d、b與e、c與f）。

結(jié)論：討論
總結(jié)
使用TUNL觸摸屏操作性條件反射分析，評(píng)估了小鼠（C57BL/6J，DBA/2J）、樣本和選擇階段之間的延遲（0、5、10、15秒）、選擇階段刺激之間的水平距離（1、2、3）、選擇階段刺激之間的垂直距離（1、2）以及這些變量之間的相互作用對(duì)TUNL性能的影響。C57BL/6J小鼠相對(duì)于DBA/2J小鼠表現(xiàn)出更好的TUNL辨識(shí)；樣本和選擇階段之間的延遲增加損害了TUNL辨識(shí)；增加水平距離有利于TUNL辨識(shí)；增加垂直距離會(huì)影響TUNL辨識(shí)。除了這些主要影響外，我們還觀察到應(yīng)變和延遲的統(tǒng)計(jì)顯著交互作用，以及應(yīng)變和水平距離的統(tǒng)計(jì)顯著交互作用。當(dāng)選擇相刺激出現(xiàn)在最寬的水平距離時(shí)，C57BL/6J小鼠和DBA/2J小鼠的TUNL表現(xiàn)在所有延遲都是等效的。相反，當(dāng)選擇相刺激出現(xiàn)在較窄的距離（即，相對(duì)較難辨別）時(shí)，DBA/2J小鼠的表現(xiàn)相對(duì)于C57BL/6J小鼠明顯受損。這種性能損害在多個(gè)延遲時(shí)觀察到，最一致的是在0秒延遲時(shí)，當(dāng)模式分離而不是工作記憶預(yù)期可以解釋性能變化時(shí)。總的來說，這些數(shù)據(jù)揭示了DBA/2J小鼠相對(duì)于C57BL/6J小鼠的模式分離損傷，但不是工作記憶損傷。
任務(wù)參數(shù)對(duì)小鼠TUNL表現(xiàn)的影響：延遲、水平距離和垂直距離，延遲（b）和水平距離（圖2c，d）的影響與預(yù)期一致，具體來說，辨識(shí)能力隨著延遲持續(xù)時(shí)間的增加而下降，而隨著水平距離的增加而提高。相比之下，垂直距離對(duì)辨識(shí)能力的影響不如預(yù)期。具體來說，在選擇階段，當(dāng)樣本圖像和新圖像出現(xiàn)在同一行（靠得更近）而不是不同行（相距更遠(yuǎn)）時(shí)，小鼠的表現(xiàn)明顯更好（e，f）。這一觀察結(jié)果與最初的TUNL研究（使用大鼠進(jìn)行）的一般觀察結(jié)果形成對(duì)比，即當(dāng)實(shí)驗(yàn)圖像較遠(yuǎn)時(shí)，模式分離最容易。對(duì)本研究中違反直覺的發(fā)現(xiàn)的一種可能解釋是，小鼠對(duì)頂行或底行都有反應(yīng)。當(dāng)刺激物在同一行時(shí)，頂部或底部偏差不會(huì)影響表現(xiàn)。相反，當(dāng)刺激位于不同的行時(shí)，對(duì)頂部或底部行做出反應(yīng)的偏差會(huì)影響表現(xiàn)。在未來的研究中，這個(gè)問題可以通過排除垂直距離作為變量來解決（即，僅使用一行刺激）。據(jù)我們所知，水平和垂直距離對(duì)TUNL性能的顯著影響從未分離。相反，刺激物之間的距離被視為一個(gè)單一變量，通過增加垂直和水平距離22進(jìn)行操縱。本研究的結(jié)果表明，至少在小鼠中，水平距離和垂直距離應(yīng)被視為TUNL分析的獨(dú)立變量。

參考文獻(xiàn)：Dickson, P.E., Mittleman, G. Working memory and pattern separation in founder strains of the BXD recombinant inbred mouse panel. Sci Rep 12, 69 (2022). 關(guān)于小鼠觸屏系統(tǒng)設(shè)備的更多資料，歡迎咨詢：
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