羧酸酯酶（CarE）活性測定試劑盒使用說明書

 
注    意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
哺乳動物CarE，也稱脂族酯酶（aliesterase），廣泛分布于組織和器官，屬于絲氨酸水解酶家族。CarE催化含酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性與外源性物質(zhì)水解，但不能催化水解乙酰膽堿及其類似物。CarE參與脂質(zhì)運輸和代謝，并且與多種藥物、環(huán)境毒物以及致癌物的解毒和代謝有關(guān)，有機磷農(nóng)藥可結(jié)合并且抑制CarE活性。
 
測定原理：
CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固藍顯色；在450 nm光吸收增加速率，計算CarE活性。
自備儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制：
試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體30mL×2瓶， 4℃保存；
試劑三：粉劑×2支， 4℃保存，臨用前取1支試劑三，加1.2ml無水乙醇充分溶解；
試劑四：粉劑×2支，-20℃保存，臨用前取1支試劑四，加少量試劑二溶解；
工作液配制：臨用前配制，向1瓶試劑二中，加入溶解后的試劑三和試劑四各1支，充分溶解，過濾，4℃避光保存，可用1周。
 
樣本的前處理：
1、細菌、細胞樣品制備
收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每200萬細菌或細胞加入400μL試劑一，超聲波破碎細菌或細胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；12000g 4℃離心30min，取上清液待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿；12000g 4℃離心30min，取上清液待測。
3、液體：直接測定。
 
測定步驟：
1. 分光光度計預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到450 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30 min。
3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入5μL蒸餾水和1000μL試劑二，迅速混勻，于450nm處測定3min內(nèi)吸光值變化，第10s吸光值記為A1，第190s吸光值記為A2�！鰽空白管=A2-A1
4. 測定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入5μL上清液和1000μL試劑二，迅速混勻，于450nm處測定3min內(nèi)吸光值變化，第10s吸光值記為A3，第190s吸光值記為A4�！鰽測定管=A4-A3
注意：空白管只需測定一次。

CarE活性計算公式：
1 組織中CarE活性

• 按照蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個酶活單位。
CarE酶活(U/mg prot)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
= 67×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr
Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V樣：加入上清液體積，0.005 mL；T：反應(yīng)時間，3min。V反總：1.005mL；蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

• 按照樣品質(zhì)量計算

單位的定義：每g組織在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個酶活單位。
CarE酶活(U/g 鮮重)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷W÷T
= 67×(△A測定管-△A空白管)÷W
V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入上清液體積(mL)，0.005 mL；V反總：1.005mL；W：樣品質(zhì)量（g）；T：反應(yīng)時間（min），3min。
2 細菌或細胞中CarE活性
單位的定義：每1萬個細菌或細胞在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個酶活單位。
CarE酶活(U/10⁴ cell)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷細胞密度（10⁴ cell/mL）÷T
= 67×(△A測定管-△A空白管)÷細胞密度（10⁴ cell/mL）
V總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入上清液體積(mL)，0.005 mL；V反總：1.005mL ；T：反應(yīng)時間（min），3min。
3. 液體中CarE活性
單位的定義：每毫升樣品在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個酶活單位。
CarE酶活(U/mL )= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷V樣÷T
= 67×(△A測定管-△A空白管)
V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入上清液體積(mL)，0.005 mL；V反總：1.005mL；T：反應(yīng)時間（min），3min。