轉(zhuǎn)錄組測(cè)序助力徐輝雄教授團(tuán)隊(duì)最新成果登陸Nature Communication

外科手術(shù)是實(shí)體腫瘤的一線治療手段。然而，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，高達(dá)30%-40%的癌癥患者在術(shù)后5年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，并且術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的重要原因。目前，侵入性手術(shù)對(duì)腫瘤和腫瘤微環(huán)境的生物學(xué)效應(yīng)及具體機(jī)制尚不清楚。闡明術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的誘發(fā)機(jī)制對(duì)于開發(fā)潛在的輔助治療策略，規(guī)避術(shù)后不良反應(yīng)，延長(zhǎng)患者的生存期尤為必要。
 

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院徐輝雄教授團(tuán)隊(duì)繼去年報(bào)道了一種以生物凝膠原位支架為基礎(chǔ)的化學(xué)免疫療法-OX&IPI549@Gel治療不完全微波消融腫瘤的新策略后，近期該團(tuán)隊(duì)在Nature Communication（IF 17.694）發(fā)表題為“Nanoparticle-enhanced radiotherapy synergizes with PD-L1 blockade to limit post-surgical cancer recurrence and metastasis”的文章。該研究運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（中科新生命提供服務(wù)）和免疫相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)研究了外科手術(shù)（SR）對(duì)腫瘤微環(huán)境（TME）的生物學(xué)效應(yīng)和分子機(jī)制，并針對(duì)性開發(fā)了一種放射免疫療法——使用放射免疫刺激納米藥物（IPI549@HMP）結(jié)合放療（RT）并與aPD-L1聯(lián)用，為術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的治療干預(yù)提供了新策略。
 

 
研究材料

CT26和B16F10細(xì)胞系，BALB/c和C57BL/6雌性小鼠

技術(shù)路線

步驟1：機(jī)制研究

a) 小鼠模型研究SR后殘余腫瘤生長(zhǎng)情況、小鼠生存情況；

b) RNA-Seq、多色免疫熒光染色（PIF）和流式細(xì)胞（FCM）檢測(cè)研究SR后免疫抑制TME的形成機(jī)制；

步驟2：納米藥物IPI549@HMP的制備及表征

a) IPI549@HMP的制備及理化性質(zhì)分析；

b) 體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)IPI549@HMP的放療增敏效應(yīng)及藥代動(dòng)力學(xué)和安全性；

步驟3：療效評(píng)估

a) 荷瘤小鼠靜脈注射IPI549@HMP治療，分析納米藥物對(duì)SR后殘余腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果；

b) 荷瘤小鼠接受不同療法后，與免疫反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞類群和分子標(biāo)記物的檢測(cè)；

c) 模擬腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，研究不同療法對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移灶的抑制作用；

d) 模擬繼發(fā)性腫瘤接種實(shí)驗(yàn)，研究不同療法對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的抑制作用。

研究結(jié)果

1. 機(jī)制研究：SR驅(qū)動(dòng)的免疫抑制加速了局部腫瘤進(jìn)展

小鼠接種腫瘤細(xì)胞10天后進(jìn)行SR處理，同時(shí)設(shè)置未處理組和假手術(shù)組對(duì)照。相比未處理組，SR處理后小鼠腫瘤起初減少，但后期腫瘤生長(zhǎng)加速，最終比對(duì)照組小鼠腫瘤更大（圖1 a-c），這些結(jié)果表明SR后殘留腫瘤的存在加速了癌癥進(jìn)展。RNA-Seq數(shù)據(jù)表明，SR后殘留腫瘤中引發(fā)復(fù)雜的炎癥反應(yīng)和缺氧，最終誘導(dǎo)了術(shù)后局部免疫抑制TME（圖1 d-h）。PIF和FCM檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)SR誘導(dǎo)了以缺氧和骨髓細(xì)胞的大量浸潤(rùn)為特征的免疫抑制TME，從而促進(jìn)了癌癥進(jìn)展（圖 1i-q）。

圖1 SR驅(qū)動(dòng)的免疫抑制加速了局部腫瘤進(jìn)展

2. 材料制備：基于HMP的納米系統(tǒng)的合成與表征

如圖 2a所示，設(shè)計(jì)合成納米藥物IPI549@HMP用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。理化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明IPI549@HMP可作為有效載藥的理想納米載體，并具有超靈敏TME響應(yīng)藥物釋放效率。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明IPI549@HMP為低毒性納米顆粒，可以安全地靜脈內(nèi)給藥；此外IPI549@HMP還具備高生物相容性及出色的腫瘤特異性磁共振成像能力（圖 2b-i）。

圖2 基于HMP的納米平臺(tái)的原理圖和特性

3. IPI549@HMP療效評(píng)估

3.1 IPI549@HMP + RT抑制術(shù)后腫瘤進(jìn)展

對(duì)CT26荷瘤小鼠（結(jié)直腸癌模型）靜脈注射IPI549@HMP治療后，體內(nèi)光聲成像、血氧飽和O₂檢測(cè)和HIF-1α染色結(jié)果證實(shí)IPI549@HMP具備出色的靶向腫瘤富集和緩解腫瘤缺氧狀態(tài)的能力。此外，腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)小鼠模型經(jīng)IPI549@HMP聯(lián)合RT治療后，殘留腫瘤的生長(zhǎng)速度最慢，所有小鼠均存活60天，完全緩解率為50%（圖 3a-f）。這一療效在黑色素瘤小鼠模型中得到了驗(yàn)證。
 

圖3 IPI549@HMP + RT抑制術(shù)后腫瘤進(jìn)展

3.2 IPI549@HMP + RT改善術(shù)后免疫微環(huán)境

WB和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IPI549@HMP聯(lián)合RT治療能夠抑制PI3Kγ、促進(jìn)CRT和HMGB1的表達(dá)，這些結(jié)果表明聯(lián)合治療的良好療效是由于增強(qiáng)免疫原性細(xì)胞死亡效應(yīng)和逆轉(zhuǎn)免疫抑制的協(xié)同作用（圖 3g、h）。FCM分析顯示，IPI549@HMP聯(lián)合RT療法有效提高了腫瘤浸潤(rùn)性CD8⁺ T細(xì)胞的浸潤(rùn)并減少了骨髓來源的抑制細(xì)胞（MDSC）的募集（圖 4a-f）。抗腫瘤免疫穩(wěn)態(tài)指標(biāo)CD8/Treg、CD8/MDSC及M1/M2比率顯著改善，PIF分析進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果（圖 4g-i）。此外，IPI549@HMP 聯(lián)合RT治療后小鼠血清TNF-α和IFN-γ分泌水平上升，表明這種放射免疫治療策略能夠引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)（圖4j、k )。
 

圖4 由IPI549@HMP增強(qiáng)RT觸發(fā)的強(qiáng)大抗腫瘤免疫反應(yīng)

3.3 IPI549@HMP + RT + PD-L1引發(fā)遠(yuǎn)隔效應(yīng)

考慮到轉(zhuǎn)移是大多數(shù)腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)患者的死亡原因，理想的術(shù)后治療不僅需要抑制原發(fā)殘余腫瘤，還應(yīng)該能夠控制或清除轉(zhuǎn)移灶。雙側(cè)CT26荷瘤小鼠模型實(shí)驗(yàn)表明，單獨(dú)注射的抗PD-L1（aPD-L1）對(duì)原發(fā)性和遠(yuǎn)處腫瘤的抑制幾乎沒有效果，IPI549@HMP + RT療法可以在一定程度上抑制原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)，但不能對(duì)遠(yuǎn)處腫瘤產(chǎn)生影響。而IPI549@HMP + RT + aPD-L1療法不僅能根除原發(fā)性殘留腫瘤，并且還顯著抑制了遠(yuǎn)處腫瘤的生長(zhǎng)（圖 5a-e）。此外，F(xiàn)CM和FIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IPI549@HMP + RT + aPD-L1治療后，小鼠模型腫瘤相關(guān)的細(xì)胞和分子特征顯著改善（圖 5f-p）。這些結(jié)果表明IPI549@HMP + RT + aPD-L1療法可以進(jìn)一步產(chǎn)生強(qiáng)大的全身抗腫瘤免疫反應(yīng)，這對(duì)于引發(fā)遠(yuǎn)隔效應(yīng)至關(guān)重要。
 

圖5 IPI549@HMP增強(qiáng)RT + PD-L1阻斷的遠(yuǎn)隔效應(yīng)

3.4 長(zhǎng)期免疫記憶效應(yīng)

作為適應(yīng)性免疫的標(biāo)志，免疫記憶效應(yīng)可以長(zhǎng)期保護(hù)機(jī)體抵御二次病原體攻擊，這對(duì)腫瘤的預(yù)防至關(guān)重要。在聯(lián)合治療后第46天接種了繼發(fā)性CT26腫瘤來評(píng)估IPI549@HMP + RT + aPD-L1治療產(chǎn)生的免疫記憶效應(yīng)（圖 6a )。與對(duì)照小鼠中觀察到快速的腫瘤進(jìn)展相比，聯(lián)合免疫療法處理后的小鼠中沒有觀測(cè)到繼發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)并且都存活了100天。此外，聯(lián)合免疫療法處理后小鼠效應(yīng)記憶T細(xì)胞（Tem）比例和血清細(xì)胞因子分泌水平顯著提升。這些結(jié)果表明聯(lián)合免疫療法處理小鼠具有顯著的免疫記憶效應(yīng)，并建立了強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)，持久保護(hù)小鼠以防止腫瘤復(fù)發(fā)（圖 6b-j）。

圖6 長(zhǎng)期免疫記憶效應(yīng)

 小編小結(jié)

本文通過對(duì)SR后腫瘤復(fù)發(fā)機(jī)制的研究，確定免疫抑制TME的形成為腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素�；�于此，研究者設(shè)計(jì)了一種放射免疫刺激納米藥物（IPI549@HMP），聯(lián)合RT對(duì)TME重編程，輔以aPD-L1治療可抑制/根除局部殘留和遠(yuǎn)端腫瘤，并引發(fā)強(qiáng)大的免疫記憶效應(yīng)以抵抗腫瘤的復(fù)發(fā)。本研究為術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了一種簡(jiǎn)單有效的治療干預(yù)策略。