免疫組織化學(xué)技術(shù)具體操作步驟和應(yīng)用

1.檢測(cè)標(biāo)本

免疫組織化學(xué)技術(shù)可用于檢測(cè)石蠟切片、冰凍切片及細(xì)胞涂片。大部分抗體可用于石蠟切片，而適用于石蠟切片的抗體也適用于冰凍切片和細(xì)胞涂片。冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織抗原，但是缺點(diǎn)也很明顯，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較差，定位不是很清晰。石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)是組織形態(tài)結(jié)構(gòu)好，定位清晰，但是在樣品的處理過(guò)程中容易破壞組織抗原[4]。下面主要是圍繞實(shí)驗(yàn)室常用的石蠟切片的操作進(jìn)行總結(jié)。

2.組織固定

組織離體后應(yīng)立即進(jìn)行固定，盡可能保存組織細(xì)胞內(nèi)的抗原成分和原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織抗原彌散。固定的方式多采用固定液浸泡組織，常用的固定液是甲醛，固定液的濃度是4%甲醛溶液（10%福爾馬林溶液，PH7.2-7.4），固定液用量大概是組織的10-20倍，標(biāo)記的組織塊不宜過(guò)大。判斷組織是否固定良好，可以取出已經(jīng)固定完畢的組織標(biāo)本用刀切開(kāi)，如固定良好，其切面呈灰白色，質(zhì)感較硬而具有彈性。

3.組織脫水

從固定液中取出的組織，建議用流水沖洗，去除過(guò)多的固定液和組織所產(chǎn)生的分解產(chǎn)物，避免污染組織。組織脫水的目的是使得組織內(nèi)的水分逐步被替換出來(lái)，因?yàn)榻M織制成蠟塊是要求組織要被熔化的石蠟所浸透，因?yàn)槭�蠟和水不相溶，脫水干凈后才有助于下一步組織的浸蠟。脫水一般采用從低到高濃度乙醇脫水，組織經(jīng)過(guò)70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，其中95%乙醇和100%乙醇經(jīng)兩缸試劑脫水。

4.組織透明

組織透明的目的是把脫水劑乙醇將組織內(nèi)用透明劑（二甲苯）置換出來(lái)，以利于熔化的石蠟進(jìn)入組織，組織經(jīng)脫水透明后，肉眼可見(jiàn)整塊組織呈透明狀，沒(méi)有白色渾濁的狀態(tài)，常用的透明劑是二甲苯，在室溫透明時(shí)間，組織透明時(shí)間以30-60分鐘為宜，不宜過(guò)長(zhǎng)，依據(jù)組織的大小肉眼觀察組織適當(dāng)調(diào)整透明時(shí)間。

5.組織浸蠟和包埋

常用的包埋劑是石蠟，石蠟在60-62℃電熱恒溫箱內(nèi)保持熔化狀態(tài)，將組織在其內(nèi)浸透一定時(shí)間，一般組織一般為2-4小時(shí)，分2缸石蠟按順序進(jìn)行操作。包埋時(shí)將包埋模具放在自動(dòng)包埋機(jī)的出蠟嘴下方，注入熔化的石蠟，用鑷子把組織輕輕按平，放在自動(dòng)包埋機(jī)的冷凍臺(tái)上凝固，凝固后脫去包埋模具。

6.石蠟切片

切片厚度一般為4-5μm，展片可先放在5%-10%的乙醇內(nèi)然后轉(zhuǎn)移到恒溫（40-46℃）水中。貼片后切片放滿(mǎn)一抽，放入60-65℃烤箱中烤片20-30分鐘，使得水分蒸發(fā)和石蠟熔化，取出即可進(jìn)行染色。也可45℃烤片數(shù)小時(shí)，直至將蠟片水分烤干，烤片后的白片可在4℃進(jìn)行保存。

7. 抗原修復(fù)

常用的抗原修復(fù)方法主要有蛋白酶法和熱處理法。主要介紹熱處理法，熱處理主要包括加熱、微波爐加熱和高壓鍋加熱，熱處理的溶液常用的是檸檬酸緩沖液（PH=6.0）。加熱條件為：水浴鍋100℃15分鐘，微波爐加熱使溫度保持在95-100攝氏度，總時(shí)間10分鐘，中間有間隔。

8.內(nèi)源性酶的消除

組織中的一些細(xì)胞如紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等存在內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，這些酶與辣根過(guò)氧化酶類(lèi)似也可以與顯色劑DAB結(jié)合，進(jìn)而造成假陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)中可通過(guò)用3%的過(guò)氧化氫水溶液作用15分鐘，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶操作可以在加一抗之前操作也可在加一抗之后操作。

9.血清封閉

血清封閉的目的是去除非特異性的吸附，用正常的非免疫動(dòng)物血清封閉組織中的能和抗體結(jié)合的位點(diǎn)，減少非特異性的背景，如二抗使用的是山羊抗兔的血清，則封閉血清選擇正常的山羊血清。血清封閉后，不用PBS沖洗，直接棄去即可，直接滴加一抗。

10.抗體孵育

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇目標(biāo)一抗，可根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)選擇抗原修復(fù)的條件，初次實(shí)驗(yàn)時(shí)建議，稀釋不同抗體的濃度，優(yōu)化最佳的抗體濃度。

11.顯色與復(fù)染

常用的染色劑主要是3,3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）,可以直接購(gòu)買(mǎi)商品化的試劑，DAB的顯色原理是在HRP的催化下，H2O2將DAB氧化成還原型的DAB,還原型的DAB呈棕色的不溶性沉淀。常見(jiàn)的細(xì)胞核復(fù)染試劑有蘇木素、甲基綠和核固紅，依據(jù)對(duì)比清晰的原則，DAB的細(xì)胞核復(fù)染主要用蘇木素。蘇木素復(fù)染后脫水、透明用中性樹(shù)膠封片。