文獻(xiàn)解讀：來自鯊魚的納米抗體可有效中和多個新冠變異株

自2019年12月首次發(fā)現(xiàn)以來，新冠肺炎（COVID-19）目前已造成全球5.8億人感染，超過600萬人死亡。盡管疫苗和藥物在不斷上市，但Delta和Omicron等多個變異株的出現(xiàn)給疾病的預(yù)防和治療帶來了相當(dāng)大的挑戰(zhàn)，因此迫切需要更多且有效的預(yù)防和治療策略。

廣譜性中和抗體的開發(fā)是一種有希望應(yīng)對目前新冠大流行的策略之一。近年來，來自駱駝等動物的單域抗體受到了廣泛關(guān)注。單域抗體指僅含有重鏈可變區(qū)的抗體片段，其分子量（15kD）遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于人類抗體（150kD），通常被稱為納米抗體。該抗體不僅具有親和力高、熱穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低等特點，還能與傳統(tǒng)抗體無法接觸的表位結(jié)合。

近日，廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國家重點實驗室、廣州實驗室、中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、廈門聯(lián)合呼吸健康研究院等多個機(jī)構(gòu)的研究人員在Small Methods雜志上發(fā)表了題為“A Class of Shark-Derived Single-Domain Antibodies can Broadly Neutralize SARS-Related Coronaviruses and the Structural Basis of Neutralization and Omicron Escape”的研究論文。研究人員從鯊魚中篩選出一種單域抗體，能夠有效中和新冠病毒的多個變異株，為預(yù)防和治療COVID-19提供了新的選擇。

研究材料和方法
研究主要使用了鯊魚、293T、VeroE6細(xì)胞，C57BL/6背景的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠（由賽業(yè)生物提供）、Balb/c小鼠等。

研究人員主要使用了細(xì)胞轉(zhuǎn)染、噬菌體文庫構(gòu)建、ELISA、WB等實驗技術(shù)。

技術(shù)路線

01通過免疫鯊魚篩選出抗新冠病毒的納米抗體

02ELISA評估納米抗體中和SARS-CoV-2變異株的能力

03分析納米抗體在hACE2小鼠的預(yù)防和保護(hù)作用

04晶體結(jié)構(gòu)解析納米抗體與病毒的結(jié)合位點

05探索Omicron變異株免疫逃逸的機(jī)制

研究結(jié)果
01 20G6和17F6納米抗體可廣泛中和SARS-CoV-2變異株
之前的研究發(fā)現(xiàn)，來自駱駝的單域抗體能夠與SARS-CoV-2刺突蛋白的受體結(jié)合區(qū)域（Receptor Binding Domain, RBD）結(jié)合。鯊魚的免疫系統(tǒng)也會產(chǎn)生一種單域抗體，即可變的新抗原受體（Variable New Antigen Receptor, VNAR），大小相當(dāng)于人類抗體的十分之一。于是，研究人員以人工飼養(yǎng)的條紋斑竹鯊作為研究對象，用SARS-CoV-2刺突蛋白對鯊魚進(jìn)行免疫接種，并構(gòu)建了噬菌體展示文庫。

經(jīng)過三輪生物淘選，他們獲得了26個與武漢病毒株的RBD區(qū)域特異結(jié)合的納米抗體。其中，納米抗體20G6和17F6的RBD結(jié)合活性最高。后續(xù)分析表明，這兩種納米抗體還能與SARS-CoV-2的Alpha、Beta、Kappa、Delta等變異株的RBD結(jié)合，親和力在皮摩爾級別。因此，20G6和17F6對多個值得關(guān)注變異株的RBD具有廣泛的反應(yīng)性。

之后，研究人員利用假病毒中和測定法來評估20G6和17F6對SARS-CoV-2武漢毒株及多個變異株的中和能力，發(fā)現(xiàn)20G6和17F6單體和二聚體都可以中和SARS-CoV-2變異株，其半數(shù)最大抑制濃度在納摩爾范圍。病灶減少中和實驗的結(jié)果也表明，單價和二價形式的20G6和17F6納米抗體可以中和SARS-CoV-2變異株。

02 20G6納米抗體對接種新冠病毒的小鼠具有預(yù)防和治療作用
研究人員接著評估納米抗體在新冠病毒感染hACE2小鼠過程中是否具有預(yù)防和治療作用。他們在小鼠的鼻腔內(nèi)滴入20G6納米抗體，然后用武漢毒株或Beta變異株感染小鼠。與對照組相比，預(yù)防組小鼠體內(nèi)病毒基因組RNA拷貝數(shù)下降。另外，他們用武漢毒株或Beta變異株感染小鼠后，通過腹膜注射或鼻內(nèi)滴注的方式給予20G6-Fc，發(fā)現(xiàn)治療組小鼠體內(nèi)病毒基因組RNA的拷貝數(shù)也下降（圖1），此外，預(yù)防組和治療組小鼠體重均未顯著下降，而且肺病理學(xué)特征顯著減少。這些結(jié)果表明，20G6納米抗體能夠在預(yù)防和治療模型中有效保護(hù)小鼠免受SARS-CoV-2武漢毒株和Beta變異株感染。
 

圖1 20G6納米抗體對SARS-CoV-2感染的預(yù)防和治療效果

03 納米抗體通過WXGY基序與RBD結(jié)合
為了探索這兩種納米抗體有效中和病毒的結(jié)合位點，研究人員從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度繼續(xù)開展研究。他們發(fā)現(xiàn)，20G6和17F6在CDR3中都包含一個獨特的“WXGY基序”，作為納米抗體與RBD相互作用的中心（圖2）。這個基序通過β-折疊與RBD上的隱藏表位（365-380）結(jié)合，而該表位在β-冠狀病毒中是高度保守的，表明這兩種抗體具有廣泛的中和活性。

有趣的是，他們發(fā)現(xiàn)20G6和17F6納米抗體能夠有效中和穿山甲冠狀病毒和蝙蝠冠狀病毒，卻不能中和Omicron和SARS-CoV-1病毒，那么Omicron變異株如何實現(xiàn)免疫逃逸？他們通過突變分析發(fā)現(xiàn)，Omicron RBD上的S375F突變可破壞RBD的β-鏈結(jié)構(gòu)，從而削弱抗體與抗原的相互作用，使得Omicron變異株和SARS-CoV-1逃逸納米抗體中和。
 

圖2 20G6納米抗體結(jié)合并中和β-冠狀病毒的能力

研究結(jié)論
本研究從鯊魚體內(nèi)篩選出兩個納米抗體，通過鼻腔給藥可預(yù)防大多數(shù)SARS-CoV-2變異株的感染。納米抗體通過WXGY基序與RBD結(jié)合，具有廣譜結(jié)合能力，但Omicron變異株除外，S375F突變是Omicron變異株逃逸抗體中和的主要突變點。該研究為新冠病毒逃逸機(jī)制的研究及疫苗抗體的開發(fā)提供思路。

原文檢索：
Feng B, Chen Z, Sun J, et al. A Class of Shark-Derived Single-Domain Antibodies can Broadly Neutralize SARS-Related Coronaviruses and the Structural Basis of Neutralization and Omicron Escape. Small Methods. 2022 Jul;6(7):e2200387. doi: 10.1002/smtd.202200387.