Science文獻解讀：反向助攻，內源性鎮(zhèn)痛失敗促進病理性疼痛的形成

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文獻精讀第31期

文章概述
疼痛是機體的一種預警系統，能夠保護生物體免受真實或潛在的組織損傷。在過度疼痛的情況下，由于內源性鎮(zhèn)痛系統的存在，這種不愉快的感覺可以有效地被控制。越來越多的證據表明，內源性鎮(zhèn)痛的失敗可能是一些病理性疼痛超敏反應的基礎，但其潛在機制仍不清楚。2022年7月27日，法國波爾多大學的研究人員在《Science Advances》雜志上發(fā)表題為“Switch of serotonergic descending inhibition into facilitation by a spinal chloride imbalance in neuropathic pain”的文章。在該研究中，作者通過光遺傳學技術來調控Naïve和神經病理性疼痛動物的5-HT下行通路，揭示了內源性血清素源性疼痛調節(jié)不穩(wěn)定的機制。以已知的投射到脊髓背角（dorsal horn of the spinal cord, DHSC）的中縫核（Nucleus Raphe magnus, RMg）血清素能（5-HT）神經元為目標。作者發(fā)現，這一特定群體可通過激活局部脊髓抑制性中間神經元來介導下行抑制。在神經損傷的動物中，由于脊髓氯失調，這種下行抑制轉變?yōu)橄滦幸谆�。通過使脊髓氯穩(wěn)態(tài)正�；�可以恢復5-HT神經元的下行抑制，并使得5-HT再攝取抑制劑（Selective Serotonin Reuptake Inhibitors, SSRIs）能夠對神經病理性疼痛產生鎮(zhèn)痛效果。該研究結果提示了一個治療神經病理性疼痛的新途徑。
 

核心觀點

1、下行的RMg 5-HT神經元在Naïve小鼠中具有鎮(zhèn)痛作用，而在神經病理性疼痛模型小鼠中則進一步促進痛覺過敏；

2、脊髓KCC2功能低下使得RMg 5-HT神經元的疼痛下行抑制轉變?yōu)橄滦幸谆�；KCC2增強子可恢復5-HT介導的下行抑制和鎮(zhèn)痛；

3、結合SSRIs和KCC2增強子可以有效的緩解神經損傷引起的痛覺過敏。

 

研究結果分析

1. RMg 5-HT神經元的光遺傳激活導致脊髓5-HT選擇性的釋放

為了明確了RMg 5-HT神經元在傷害性信號傳遞中的作用。作者首先通過轉基因小鼠確定了5-HT神經元在DHSC的淺表和深層中存在神經投射。隨后，作者通過病毒注射的方法在5-HT神經元中表達ChR2蛋白。三周后，ChR2在RMg的5-HT神經元的胞體以及DHSC的投射中都有表達。全細胞膜片鉗記錄顯示，5-HT神經元動作電位能夠忠實地被光刺激所觸發(fā)。利用高效液相色譜對DHSC進行測量，作者觀察到光刺激激活5-HT神經元引起了DHSC中5-HT水平的顯著增加。
 

2. 脊髓中RMg 5-HT神經末梢的光遺傳激活產生陣痛作用
然后，作者在注射部位上方（RMg）對5-HT神經元進行了光遺傳刺激。結果顯示，激活RMg 中的5-HT神經元對動物的機械痛和熱痛均產生了強烈的抑制作用。為了聚焦于投射到DHSC的下行通路，作者在脊髓上方對5-HT神經末梢進行光遺傳激活，觀察到了與上述相同的結果，表明5-HT誘導的鎮(zhèn)痛是由于DHSC中的5-HT神經投射激活產生的。
 

 

3. RMg 5-HT神經元能夠抑制脊髓痛覺
為了證實這種鎮(zhèn)痛作用是由于直接調控了DHSC中傷害性信息傳遞，作者進行了在體電生理記錄。作者首先評估了光遺傳刺激5-HT神經元的整體后果，在光遺傳刺激下，小鼠的痛覺場電位（Nociceptive field potentials, NFPs）降低，這種效應在雄性和雌性中是相同的，證實了5-HT誘導的鎮(zhèn)痛是由于改變了DHSC中的傷害感受傳遞。為了確定痛覺信息的減少是否局限于DHSC水平，作者記錄了投射之外的DHSC深部神經元，記錄限制在廣動力范圍神經元中（Wide Dynamic Range neurons, WDRs)，這些神經元高度收斂，并表現出明顯的c成分（即在相應的感受域受到超閾值電刺激后出現延遲反應，可作為痛覺傳遞的讀出）。在光遺傳刺激期間，作者觀察到c-纖維范圍內的動作電位數量減少，這種下降在雄性和雌性動物中一致。
 

 

4.RMg 5-HT的鎮(zhèn)痛作用于脊髓局部GABA能/甘氨酸能神經元

隨后，作者進一步確定了參與這種鎮(zhèn)痛的脊髓微環(huán)路。通過對條件性標記5-HT纖維結合組織免疫染色，作者比較了小鼠DHSC中5-HT纖維與興奮性（tlx3）或抑制性神經元（Pax2）標記物的位置。結果顯示，在雄性和雌性中，5-HT纖維與Pax2的接觸比tlx3更密切，這表明5-HT纖維與脊髓局部抑制性中間神經元之間存在聯系。為了證實這一假設，作者使用GABA能神經元熒光標記的小鼠并進行TPH2免疫染色，在GABA能中間神經元的胞體和纖維上發(fā)現了5-HT+末梢。另外，作者利用病毒介導的條件表達方式，對RMg中的5-HT神經元進行標記，并在DHSC的深層中發(fā)現了突觸末端。最后作者利用雜交的轉基因小鼠結合病毒介導的條件表達的方式，觀察到DHSC中RMg 5-HT的神經投射與GABA能神經元的胞體和纖維上形成的突觸連接。
 

 

為了確定光遺傳刺激是否激活DHSC中的抑制性中間神經元，作者在光遺傳刺激進行了cFos/ Pax2免疫染色。結果顯示，在DHSC的淺層和深層，同時含有Pax2(+)的c-Fos(+)神經元，表明光遺傳激活5HT纖維激活了脊髓抑制性中間神經元。最后，為了證實這種鎮(zhèn)痛作用是由于RMg 5-HT神經元和DHSC中抑制性中間神經元的微環(huán)路所介導，作者評估了動物在鞘內注射拮抗劑阻斷GABAA和甘氨酸受體后，光遺傳刺激5-HT纖維時的機械和熱刺激敏感性。注射拮抗劑抑制了光遺傳刺激對小鼠的鎮(zhèn)痛作用。為了證實這種阻斷改變了DHSC的傷害性信息傳遞，作者對WDR神經元進行了體內電生理記錄，觀察到阻斷GABA/甘氨酸受體會抑制WDR神經元反應性的降低。這些結果表明，來源于RMg的5-HT纖維通過作用于脊髓中的抑制性中間神經元從而抑制脊髓傷害性信息傳遞。
 

 

5. 阻斷脊髓KCC2將RMg 5-HT的下行抑制轉換成興奮
在神經病理性疼痛模型中，氯平衡失調導致的抑制解除似乎是神經元超興奮和疼痛超敏反應的關鍵機制。因此，作者研究了是否可以通過改變DHSC中的氯平衡來逆轉RMg 5-HT神經投射的光遺傳激活效應。作者采用了兩種不同的氯轉運體阻斷劑，非選擇性的抑制劑速尿和選擇性的KCl轉運體KCC2抑制劑VU043271。在這兩種情況下，光遺傳刺激5-HT纖維均能誘導動物的疼痛敏感性顯著增加。體內電生理記錄顯示，VU043271能夠引起5-HT神經元光遺傳激活時WDR神經元反應性的切換。在給予VU043271后，當RMg 5-HT神經投射受到光遺傳刺激時，WDR神經元對外周刺激的反應增加。這些結果表明，改變氯平衡可以將血清素能抑制轉化為興奮。
 

 

6. 神經損傷引起脊髓KCC2功能低下導致RMg 5-HT的下行抑制轉換成興奮
然后，作者使用神經病理性疼痛（SNI）小鼠模型研究了5-HT下行通路在病理背景下的作用。在SNI手術后兩周，小鼠表現出強烈的機械痛和熱痛超敏反應。形態(tài)學檢查結果確定了SNI小鼠的5-HT下行神經投射結構并沒有發(fā)生變化，其密度與突觸連接與Naïve小鼠相當。在SNI小鼠中，當作者用光遺傳刺激激活脊髓中的RMg 5-HT下行纖維時，小鼠機械痛和熱痛超敏反應進一步增強。
 

 

在體電生理記錄表明，這些機械痛和熱痛過敏反應增強與DHSC神經元的反應性增加相關，在脊髓5-HT纖維末梢的光遺傳激活過程中，WDR神經元對外周刺激中c -纖維傳入的反應顯著增加。這些結果強烈提示，脊髓神經元氯離子失衡可能會通過將RMg 5-HT纖維的下行抑制作用轉換為下行易化來改變對疼痛的控制。
 

 

為了驗證這一可能性，作者使用CLP290從藥理學上增強SNI小鼠的KCC2氯轉運蛋白。作者觀察到CLP290能夠顯著誘導了DHSC神經元細胞膜上的KCC2水平增加。然后，作者評估了CLP290處理后的SNI小鼠在光遺傳刺激時的疼痛行為，5-HT纖維的光遺傳刺激顯著緩解了SNI小鼠的機械痛和熱痛過敏。利用在體電生理記錄，作者還發(fā)現，在CLP290處理后，小鼠的WDR神經元在RMg 5-HT纖維的光刺激過程中對外周刺激的反應性降低。這些結果表明，KCC2介導的氯平衡能夠控制RMg 5-HT的下行效應：正常的氯平衡能夠有效的維持RMg 5-HT下行投射的抑制作用，而神經損傷后KCC2功能低下，引起氯平衡失調，導致RMg 5-HT的下行抑制作用轉為下行易化。
 

 

7. 挽救KCC2功能恢復SSRI介導的鎮(zhèn)痛
上述機制可能解釋了為什么SSRIs不能緩解慢性疼痛患者的疼痛。為了驗證這一假設，作者將SSRI治療與KCC2增強子結合。作者觀察到，在SNI小鼠中證實單獨注射SSRI氟西汀可引起輕微的機械痛和熱痛過敏，CLP290能夠輕微但顯著地降低了機械痛和熱痛過敏。相比之下，氟西汀和CLP290聯合使用可強烈緩解機械痛和熱痛過敏，這種鎮(zhèn)痛效果在單次注射后24小時仍然存在。最后，作者利用條件性位置偏好實驗進一步證實了這種鎮(zhèn)痛作用，在測試時，SNI小鼠明顯傾向于停留在訓練時給予氟西汀+CLP290的箱體中，表明氟西汀聯合CLP290顯著改善了SNI小鼠的疼痛狀態(tài)合。
 

 

總結

該研究結果表明，RMg中下行的5-HT神經纖維通過與DHSC中的抑制中間神經元形成突觸連接，產生了對機械和熱刺激的門控作用。此外，KCC2下調是5-HT下行纖維影響痛覺傳遞信號變化的基礎，在病理狀態(tài)下由疼痛抑制向疼痛易化轉變。這些結果表明，下行興奮和抑制之間的平衡取決于脊髓水平的局部改變，這與先前的看法相反。特別是，相同的5-HT環(huán)路可以是興奮和/或抑制的，取決于目標區(qū)域的興奮性。

研究方法亮點

這項工作闡述了內源性血清素源性疼痛調節(jié)不穩(wěn)定性的作用機制。研究用到了腦立體定位注射、光遺傳學、在體電生理記錄、行為學評估以及免疫組化等實驗技術。瑞沃德深耕生命科學研究領域20年，一直致力于為客戶提供可信賴的解決方案和服務，在該研究中，瑞沃德提供了自主研發(fā)的腦立體定位注射系統，確保相關實驗操作能夠精準完成。此外，瑞沃德還可提供該研究所涉及的光遺傳學、在體電生理記錄、行為學評估以及免疫組化等實驗的完整解決方案。截至目前，瑞沃德產品及服務覆蓋海內外 100 多個國家和地區(qū)，客戶涵蓋全 球700+醫(yī)院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全 球科研人員發(fā)表SCI文章14500+，獲得行業(yè)廣泛認可。
 

原文鏈接：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abo0689