從肝臟組織中制備細(xì)胞核

一、材料與儀器：

大鼠、裂解緩沖液、濃蔗糖溶液、超速離心機(jī)、組織研磨器

二、實(shí)驗(yàn)步驟：

1、配制裂解緩沖液和濃蔗糖溶液（PMSF 在使用前添加），冰上放置。

2、超速離心機(jī)（Beckman 的與SW28轉(zhuǎn)頭兼容型）和轉(zhuǎn)頭預(yù)冷到4℃。

3、將組織研磨器（55 ml 的研磨腔； Thomas C 型腔和鋸齒型 Teflon 研杵，3431-E25）。量筒和燒杯放到冰上。

4、在一冰桶的冰上放一玻璃盤(pán)。

5、處死大鼠，取出肝臟，稱(chēng)重。

6、在一玻璃盤(pán)上，用剃刀片快速去除結(jié)締組織，將20g肝臟切成大約1cm3的小塊。

7、將肝臟碎塊裝入含40 ml ( 兩倍體積）裂解緩沖液的冷的燒杯中。

8、將大約30ml這種肝臟碎塊和緩沖液混合物倒入預(yù)冷的組織研磨器腔中。

9、 將研杵連到推進(jìn)器，便其滑到研磨腔中，直到觸到緩沖液面。然后握住研磨腔側(cè)面，打開(kāi)推進(jìn)器。逐漸加大推進(jìn)器速度直至其最高速度，同時(shí)穩(wěn)定地將研磨腔沿轉(zhuǎn)動(dòng)的研磨向上推進(jìn)。當(dāng)研杵到達(dá)研磨腔底部時(shí)，向下拉研磨腔直到所有勻漿都從研杵旁通過(guò)，然后再將研磨腔沿研杵推回。重復(fù)該過(guò)程5~10次后關(guān)掉推進(jìn)器。

10、檢查細(xì)胞的裂解效率：

(1) 將研磨腔放到冰上，取出10μl裂解液，用1ml裂解緩沖液稀釋。

(2) 取2.7μl稀釋后的裂解液加到載玻片上，再加上2.7μl 含 10μg/ml Hoechst 染料（33258 10 mg/ml；Molecular Probes 或其他供應(yīng)商）的裂解緩沖液，然后用一 18 mm2 的1號(hào)蓋玻片將液滴蓋上。

(3) 比較亮的DNA染色的細(xì)胞核與同一視野的相圖。

(4) 如果裂解細(xì)胞數(shù)少于95%，加大推進(jìn)器速度，繼續(xù)研磨樣品5~10次。

11、在一漏斗中裝入4層粗孔濾紙，放到一埋在冰浴中的量筒中，然后將勻漿倒進(jìn)漏斗。

12、裂解剩余的肝臟碎塊，勻漿通過(guò)濾紙過(guò)濾與其余裂解物樣品混和，記錄得到的裂解物體積。

13、將裂解物體積除以 6，再?gòu)碾x心管體積（35~38 ml) 中減去該體積。即可確定加入 6 個(gè)離心管中的濃蔗糖溶液的體積。在2mol/L RSB 溶液中加 PMSF 至終濃度為0.5 mmol/Lol/L。取適當(dāng)體積（通常為25~30 ml ) 加到離心管中，冰上放置。

14、向離心管中加入濃蔗糖溶液和等體積裂解物（通常7~9ml )。加裂解物時(shí)，應(yīng)將移液管頭靠在離心管內(nèi)壁上部使裂解物緩慢流下，這樣可減少裂解物與蔗糖溶液的混和。

15、將離心管放到預(yù)冷的轉(zhuǎn)桶中，對(duì)面的轉(zhuǎn)桶用裂解緩沖液平衡。

16、轉(zhuǎn)桶在SW28 轉(zhuǎn)頭上裝好，放進(jìn)預(yù)冷的離心機(jī)中，23000g，4℃離心30分鐘。

17、吸出裂解物和蔗糖溶液，或者在一燒杯上將離心管倒轉(zhuǎn)將液體倒出。用一無(wú)絨紙巾清除內(nèi)壁上的殘余物質(zhì)，離心管放置于冰上。每管加入 2 ml 裂解緩沖液重新懸浮沉淀。

18、將沉淀的重懸浮液集中到一個(gè)50ml的離心管（錐形或圓形底）中，加裂解緩沖液至 50ml 終體積，在醫(yī)用離心管中1500g離心5分鐘。

19、吸出上清，細(xì)胞核沉淀重懸浮于1 ml 的裂解緩沖液中。取出少量樣品稀釋100 倍后在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)細(xì)胞核數(shù)目。

20、用裂解緩沖液將樣品稀釋到期望濃度的兩倍，加入等體積甘油，放液氮中冷凍，-80℃保存。