項目文章：Bio Mat (IF16.874) 肌腱病疼痛難忍--細胞外囊泡大顯神威

近年來，干細胞源性的小細胞外囊泡（sEVs）在各種疾病中的治療作用得到廣泛的關注。2020年，上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院汪泱教授團隊于J Extracell Vesicles發(fā)表的“Human ESC-sEVs alleviate age-related bone loss by rejuvenating senescent bone marrow-derived mesenchymal stem cells”文章中，發(fā)現胚胎干細胞源性細胞外囊泡中含有多種年輕化因子蛋白成分，并能夠促進衰老小鼠骨髓間充質干細胞年輕化。此外，目前已有多項研究證實了sEVs治療肌腱病變的潛在機制。值得關注的是，一些針對成體干細胞衍生的大細胞外囊泡（lEVs）的研究表明，lEVs可能實現與sEVs類似的治療功能，而干細胞衍生的lEVs是否能夠有效治療肌腱病變尚不清楚。

2022年8月，汪泱教授團隊在細胞外囊泡的研究中再次獲得突破，于Bioactive Materials發(fā)表了題為“Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity“文章。文章研究了誘導性多能干細胞來源的間充質干細胞分泌的lEVs (iMSC-lEVs)在肌腱病變中的治療作用以及iMSC-lEVs在體外對巨噬細胞極化的調節(jié)作用。通過外泌體蛋白質組學、RNA測序、蛋白免疫印跡等技術方法，研究表明iMSC-lEVs能夠部分通過DUSP2和DUSP3來介導p38 MAPK信號通路，并使M1巨噬細胞向M2巨噬細胞進行極化轉變，從而減輕肌腱病變中的疼痛和炎癥。其中，中科新生命為該研究提供了細胞外囊泡蛋白質組學服務。  
研究材料
iMSC-lEVs；iMSC-sEVs；小鼠巨噬細胞細胞系RAW 264.7；大鼠肌腱病變模型；肌腱病患者肌腱組織
 
技術路線

1. iMSC-sEVs和iMSC-lEVs的分離與表征；
2. 建立大鼠肌腱病模型，并在體內評估iMSC-lEVs的鎮(zhèn)痛作用；
3. 采用RAW 264.7細胞，研究iMSC-lEVs對巨噬細胞極化的調節(jié)作用；
4. RNA-seq方法探究iMSC-lEVs調節(jié)巨噬細胞表型改變的機制；
5. 對iMSC-lEVs進行蛋白質組學分析以確定其調控通路的上游蛋白；
6. 研究iMSC-lEVs對肌腱病患者肌腱組織的作用。

 
研究結果
 

1. iMSC-sEVs和iMSC-lEVs的分離與表征

研究人員采用誘導性多能干細胞（IPSC）來源的間充質干細胞(iMSCs)作為sEVs和lEVs的產生源。利用差速離心分離法從iMSCs培養(yǎng)基中分離并收集iMSC-sEVs (100 nm左右)和iMSC-lEVs (200nm以上)，并通過透射電鏡、Western blot、NTA粒徑分析對iMSC-sEVs與iMSC-lEVs進行表征。 2.iMSC-lEVs可減輕肌腱病相關疼痛并減少體內炎癥

研究人員首先建立了大鼠肌腱病模型，并在體內評估iMSC-lEVs的鎮(zhèn)痛作用。每周以100 μL lEVs（10⁹粒/ml）劑量治療肌腱病變大鼠，與此同時在同一時間點以100 μL sEVs（10¹⁰粒/ml）劑量進行比較治療。采用靜態(tài)疼痛相關行為分析及步態(tài)分析對大鼠進行疼痛評估，結果表明，在治療4周后，應用lEVs能夠減輕肌腱病變大鼠的疼痛（圖2a）并顯著改善肌腱病變大鼠的動態(tài)行走模式（圖2b和c）。值得一提，結果表明lEVs治療具有與sEVs相似的鎮(zhèn)痛功能。此外，HE染色結果顯示，在治療4周后lEVs促進了肌腱病變中的肌腱修復（圖2d和e）。

接下來研究人員研究了lEVs對巨噬細胞表型浸潤的影響。 IHC染色結果顯示，在治療2周和4周后，lEVs治療減少M1巨噬細胞的浸潤，并促進M2巨噬細胞的浸潤（圖2d和e），且lEVs組與sEVs組無顯著差異（M1巨噬細胞浸潤可加重肌腱病相關疼痛，而M2巨噬細胞浸潤可改善肌腱病相關疼痛）。免疫組化染色顯示，治療2周和4周后，lEVs和sEVs治療均顯著降低促炎因子的表達（圖3a和b）。這些數據表明，lEVs治療在大鼠肌腱病變模型中具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，且與sEVs的能力相似。