細胞培養(yǎng)—如何應對細胞老化

細胞老化的概念

生物個體及其細胞需經(jīng)生長、發(fā)育、老化及死亡等階段，老化是生命發(fā)展的必然，任何細胞從誕生之時起，老化過程就開始了。老化的細胞結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白和受體蛋白合成減少，攝取營養(yǎng)和修復染色體損傷的能力均下降，表現(xiàn)為細胞和胞核變形，線粒體、高爾基體扭曲或呈囊泡狀，胞質(zhì)色素沉著，細胞體積縮小，由此導致器官重量減輕，間質(zhì)增生硬化，功能代謝降低，儲備功能不足。

遺傳程序?qū)W說：

遺傳程序?qū)W說（genetic programmed theory）：認為細胞的老化是由遺傳因素決定的，最終的老化死亡是遺傳信息耗竭的結(jié)果。例如體外培養(yǎng)的人成纖維細胞經(jīng)過50次分裂后便自行停止分裂；同卵雙生子“同生共死”現(xiàn)象等，都支持此學說�，F(xiàn)已了解，控制細胞分裂次數(shù)的機制與細胞內(nèi)染色體末端的端粒結(jié)構(gòu)有關(guān)。

細胞老化的基本特征

1.細胞老化最開始的現(xiàn)象通常為細胞內(nèi)部會出現(xiàn)空泡（可能是凋亡小體），也可能會出現(xiàn)黑點，大多沿細胞周邊排布，內(nèi)部中間也可能會顯現(xiàn)一些，但相對周邊為少。

2.老化以后的細胞會出現(xiàn)立體感慢慢消失，開始成扁平狀，細胞與細胞之間的間隔減小或混在一起，細胞不再是梭形，而會成為各種不規(guī)則形狀。

3.細胞折光性變差，鏡下可見細胞“變薄”，做轉(zhuǎn)染實驗時，細胞死亡率會較高。但培養(yǎng)液不會發(fā)生迅速變黃的現(xiàn)象，仍清亮。（但如果是細菌污染的話，一般會出現(xiàn)培養(yǎng)液的迅速變黃，混濁，鏡下可見大量繁殖的細菌；若是支原體污染的話，細胞也會失去正常形態(tài)，會有細胞的死亡）。

4.細胞的貼壁性減弱，開始有細胞漂浮于培養(yǎng)液中。

5.老化的細胞，表面分泌物會增多，細胞表面的純凈度越來越低。

6.分裂的細胞數(shù)量明顯地減少同時細胞的增殖速度也會大大下降。

7.細胞開始長角分化。

細胞形態(tài)改變

雖然由于細胞周期的中斷和DNA復制的停止，老化細胞內(nèi)的DNA含量與正常細胞類似，但RNA與蛋白質(zhì)豐度均比正常細胞要明顯升高。這是因為，盡管細胞進入老化階段后蛋白質(zhì)的整體合成速率降低，但是蛋白質(zhì)的降解體系受到更加明顯的抑制，導致蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)持續(xù)堆積。但，由于不同組織來源的細胞，其形態(tài)本就各不相同，因此，目前還并無客觀的、統(tǒng)一的標準從細胞形態(tài)判斷并定義老化細胞。換句話說，目前并不能直接根據(jù)細胞的形態(tài)去判斷是否老化細胞。

無論是原代細胞或是細胞株，在細胞培養(yǎng)過程中細胞老化現(xiàn)象是存在且常見的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細胞會出現(xiàn)的特征包括：細胞增殖變慢、細胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細胞體積增大、細胞扁平、細胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象。

細胞老化原因總結(jié)

1.細胞老化最開始的現(xiàn)象通常為細胞內(nèi)部會出現(xiàn)空泡（可能是凋亡小體），也可能會出現(xiàn)黑點，大多沿細胞周邊排布，內(nèi)部中間也可能會顯現(xiàn)一些，但相對周邊較少；

2.老化的細胞會出現(xiàn)細胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，胞膜起泡，皺縮等現(xiàn)象；

3.老化以后的細胞會出現(xiàn)立體感慢慢消失，開始成扁平狀，細胞與細胞之間的間隔減小或混在一起，細胞不再是梭形，而會成為各種不規(guī)則形狀；

4.細胞折光性變差，鏡下可見細胞“變薄”，做轉(zhuǎn)染實驗時，細胞死亡率會較高，但培養(yǎng)液不會發(fā)生迅速變黃的現(xiàn)象，仍清亮。（如果是細菌污染的話，一般會出現(xiàn)培養(yǎng)液的迅速變黃，混濁，鏡下可見大量繁殖的細菌；若是支原體污染的話，細胞也會失去正常形態(tài)，會有細胞的死亡）；

5.細胞的貼壁性減弱，開始有細胞漂浮在培養(yǎng)液中；

6.老化的細胞表面分泌物會增多，細胞表面的純凈度越來越低；

7.分裂的細胞數(shù)量明顯的減少，同時細胞的增殖速度也會大大下降；

8.細胞開始長角分化。

半乳糖苷酶法染色的衰老細胞

細胞培養(yǎng)中如何預防老化

1.防止細胞老化最主要還是要做到勤觀察、勤換液、勤傳代、勤保種，特別是傳代，不能等細胞太密了之后傳，一般細胞建議長到70％融合度傳代最好；

2.換培養(yǎng)液應該根據(jù)自己細胞消耗培養(yǎng)基的情況來確定是否該換。如果感覺時間不好把握的話就多培養(yǎng)幾瓶細胞，在不同的時間換液，最后再來比較下，看什么時候換液好，得出自己的結(jié)論；

3.選擇正確的血清與培養(yǎng)基：細胞對血清特別敏感，直接影響細胞的生長。一定要選擇適合的血清不然就會因營養(yǎng)物質(zhì)不協(xié)調(diào)而導致細胞老化；

4.在間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)時必然要進行消化，但是消化對細胞的表面蛋白質(zhì)有很強的破壞作用，因此不能長時間進行消化并且在選擇消化酶時也要選擇較為合適的pH和濃度，不然就會使細胞老化或者分化；

5.在開始養(yǎng)細胞并傳代時，也要特別注意凍存細胞，以保持細胞有種子庫存在，可以有效避免細胞損傷。

雖然，老化細胞不會立即死亡，但其基因表達會發(fā)生變化，如果細胞老化現(xiàn)象嚴重，建議從種子庫或工作庫重新復蘇細胞。