項(xiàng)目文章：非靶代謝組學(xué)應(yīng)用于適度降低心率促進(jìn)心肌再生機(jī)制研究

 

 研究材料

小鼠心肌細(xì)胞（NMCMs），人多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞（hPSC-CMs），心臟組織

 

 技術(shù)路線

步驟1：適度心率降低促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖；

步驟2：適度心率降低促進(jìn)心肌損傷后心臟再生；

步驟3：適度心率降低誘導(dǎo)心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期；

步驟4：適度心率降低刺激心肌細(xì)胞的代謝模式轉(zhuǎn)換；

步驟5：轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：適度心率降低促進(jìn)糖酵解酶的表達(dá)，刺激心肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期；

步驟6：代謝組學(xué)分析：適度心率降低激活心肌細(xì)胞的生物合成代謝。

 

 研究結(jié)果

1. 適度心率降低促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖

研究人員分別對(duì)12周成年小鼠進(jìn)行抗心律失常藥物和異丙腎上腺素處理4周，發(fā)現(xiàn)所有抗心律失常藥物都能使成年小鼠的心率持續(xù)降低約10%-20%，而異丙腎上腺素則有相反的效果（圖1J）。小鼠心臟組織中，抗心律失常藥物處理增加增殖型心肌細(xì)胞比例（圖1L），異丙腎上腺素處理增加總增殖細(xì)胞的比例，但未增加增殖型心肌細(xì)胞比例（圖1M）。綜上可知，適度心率降低會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。

圖1 適度心率降低促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖

 

2. 適度心率降低促進(jìn)心臟損傷后心肌再生

為了驗(yàn)證適度心率降低對(duì)心臟修復(fù)和再生的影響，研究人員分別對(duì)經(jīng)過(guò)心尖切除術(shù)的新生鼠（圖2A）和心肌梗死的成年小鼠（圖2E）進(jìn)行抗心律失常藥物處理，發(fā)現(xiàn)處理后心率降低（圖2B和2G），增殖型心肌細(xì)胞比例升高（圖2C,2D,2H和2F）�？偟膩�(lái)說(shuō)，適度心率降低可以促進(jìn)新生和成年小鼠的心臟再生。

 

圖2 適度心率降低促進(jìn)心肌損傷后心臟再生

 

3.  適度心率降低誘導(dǎo)心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期

為了深入了解適度心率降低調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖的機(jī)制，對(duì)心肌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)行了分析。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，適度心率降低可降低G1期心肌細(xì)胞的比例，增加S期心肌細(xì)胞的比例，說(shuō)明適度心率降低誘導(dǎo)心肌細(xì)胞 G1/S期轉(zhuǎn)變（圖3A）。qPCR和WB結(jié)果表明，適度心率降低可上調(diào)心肌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白(cyclin D1, E2，A2和B2)和周期蛋白依賴性激酶(CDK1, 2, 4和6) 的表達(dá)（圖3B-3D）。細(xì)胞周期基因cyclin D-CDK4/6和cyclin E-CDK2的激活對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)入、G1/S過(guò)渡和DNA復(fù)制至關(guān)重要。提示適度心率降低通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期基因的表達(dá)，從而觸發(fā)心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。
 

圖3 適度心率降低誘導(dǎo)心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期

 

4.  適度心率降低刺激心肌細(xì)胞的代謝模式轉(zhuǎn)換

能量產(chǎn)生是維持心肌細(xì)胞持續(xù)增殖的必要條件，作者進(jìn)一步探討了適度心率降低后心肌細(xì)胞的能量需求變化。發(fā)現(xiàn)適度心率降低后，NMCMs 中AMP/ATP的比值降低（圖4A）。為了進(jìn)一步揭示適度心率降低作用下心肌細(xì)胞的代謝表型，作者用Etomoxir、UK-5099和BPTEs分別抑制長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFAs)、葡萄糖和谷氨酰胺的攝入，以此來(lái)判斷NMCMs對(duì)不同底物進(jìn)行氧化磷酸化的需求，結(jié)果顯示原代心肌細(xì)胞仍主要依賴葡萄糖進(jìn)行氧化磷酸化，而降低心率后其對(duì)葡萄糖的氧化依賴進(jìn)一步增加（圖4B-4F）。綜上：適度心率降低使心肌細(xì)胞發(fā)生能量代謝重編程即能量代謝需求降低，而糖酵解是適度心率降低促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的必要步驟。

圖4 適度心率降低刺激心肌細(xì)胞的代謝模式轉(zhuǎn)換

 

5.  轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：適度心率降低促進(jìn)糖酵解酶的表達(dá)，刺激心肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期

為了確定適度心率降低誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖機(jī)制，研究人員用抗心律失常藥物處理7日齡小鼠，取心臟組織做轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果表明，通過(guò)藥物適度降低心率后，心肌細(xì)胞上調(diào)表達(dá)基因普遍與增殖和代謝調(diào)節(jié)有關(guān)，包括細(xì)胞周期過(guò)程、心臟代謝過(guò)程和核苷三磷酸代謝過(guò)程（圖5C），其中葡萄糖代謝基因表達(dá)上調(diào)（圖5D）。WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)幾個(gè)關(guān)鍵糖酵解酶上調(diào)，其中包含PKM2 (圖5E和5F)，它是參與糖酵解的關(guān)鍵酶，已被報(bào)道可通過(guò)核易位激活細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的轉(zhuǎn)錄。綜上所述，適度心率降低可以激活糖酵解酶的表達(dá)，尤其是PKM2的表達(dá)，從而刺激心肌細(xì)胞細(xì)胞周期再進(jìn)入。
 

圖5 RNA-seq功能富集結(jié)果和幾個(gè)關(guān)鍵的糖酵解酶WB結(jié)果展示

 

6.  代謝組學(xué)分析：適度心率降低激活心肌細(xì)胞的生物合成代謝

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果，適度心率降低組還富集了多種可能在調(diào)控心肌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用的代謝途徑。使用[U-¹³C₆]葡萄糖和[U-¹³C₁₆]棕櫚酸酯示蹤劑來(lái)研究適度心率降低對(duì)心肌細(xì)胞代謝通量的影響。發(fā)現(xiàn)，在適度心率降低處理的NMCMs中，葡萄糖的攝入量以及對(duì)三羧酸(TCA)中間體和其他單糖的利用均顯著增加(圖6A-6C)。此外，適度心率降低增加了NADPH的產(chǎn)生，降低了NMCMs中NADP+/NADPH的比值(圖6D)。這些結(jié)果表明，適度心率降低提高了葡萄糖通過(guò)TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑(PPP)和其他生物合成途徑的通量。代謝組學(xué)分析進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，發(fā)現(xiàn)參與生物合成代謝的代謝物豐度顯著增加(圖6E-6G)，其中差異表達(dá)最多代謝物在核苷酸糖生物合成中富集(圖6H)。
 

圖6 [U-¹³C₆]葡萄糖 and [U-¹³C₁₆] 棕櫚酸酯示蹤劑來(lái)研究適度心率降低對(duì)心肌細(xì)胞代謝通量的影響

圖7 非靶代謝展示適度心率降低使得參與核苷酸糖生物合成的代謝物豐度增加

 

 小編小結(jié)

心臟損傷后大量心肌細(xì)胞丟失和隨后的纖維化導(dǎo)致心力衰竭和突發(fā)心臟病死亡。本研究整合轉(zhuǎn)錄組，代謝流以及非靶代謝組學(xué)技術(shù)探討降低心率促進(jìn)心機(jī)損傷后心臟再生修復(fù)的分子機(jī)制。通過(guò)多組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，適度心率降低可通過(guò)糖代謝酶發(fā)揮非酶活性促進(jìn)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞細(xì)胞周期重新進(jìn)入，啟動(dòng)細(xì)胞周期蛋白轉(zhuǎn)錄，同時(shí)還激活代謝功能，為增殖細(xì)胞提供能量。本研究發(fā)現(xiàn)適度心率降低是一種體外和體內(nèi)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖的方法，這為心臟疾病的臨床治療提供了新的思路。