4D蛋白質組學解密傳統(tǒng)中藥配方清肺飲緩解肺炎的潛在機制

肺炎鏈球菌（S.pn）是一種革蘭氏陽性菌，被認為是病原體誘導的肺炎的最常見原因，同時也引起呼吸道感染、肺實質炎癥和肺部感染引起的菌血癥。而清肺飲（QFY）是一種我國傳統(tǒng)中藥配方，因其治療細菌性肺部感染的出色藥理作用而聞名，但其作用的分子機制尚不清楚。

在該研究中，研究人員在S.pn感染的小鼠中評估了清肺飲的體內療效，使用基于應用4D無標記蛋白質組學分析的方法，系統(tǒng)地比較了清肺飲治療前后蛋白質表達的變化，揭示了清肺飲預防肺炎的分子機制，為未來開發(fā)新的治療方法以對抗該疾病和減少抗生素濫用奠定了基礎。

 

文章詳情

中文題目：通過NLRP3/mTOR途徑激活自噬：清肺飲緩解肺炎的潛在機制

英文題目：Activation of Autophagy Through the NLRP3/mTOR Pathway: A Potential Mechanism for Alleviation of Pneumonia by QingFei Yin

發(fā)表時間：2022.01

發(fā)表期刊：Oxidative Medicine and Cellular Longevity

影響因子：6.5434

實驗技術：4D-label free蛋白質組學

DOI：10.3389/fphar.2021.763160.

 

研究概述

研究使用基于高效液相色譜-質譜（HPLC-MS/MS）的方法測定QFY的化學成分，然后使用兩種模型評估QFY對肺炎的保護藥理作用：一種是肺炎鏈球菌誘導的體內小鼠模型，另一種是體外溶血素（PLY）誘導的小鼠肺泡衍生MH-S細胞系模型。值得注意的是，QFY在體內和體外均具有顯著的抗肺炎作用。為了進一步探討QFY的保護作用，進行了4D無標記蛋白質組學分析、病理學評估和免疫組織化學（IHC）分析，以確定QFY保護中涉及的細胞途徑。結果表明，NF-κB/NLRP3和自噬途徑可能有助于QFY保護相關的藥理作用。簡而言之，QFY通過下調上游NLRP3/mTOR信號通路事件觸發(fā)自噬，從而改善炎癥損傷。

QFY緩解肺炎的治療機制概述。QFY通過下調上游NLRP3/mTOR信號通路事件觸發(fā)自噬，導致炎癥損傷的改善。

 

研究思路

 

研究內容

1、QFY制劑的HPLC色譜圖

本研究鑒定了QFY的19種主要化合物，這19種成分的總離子流（TIC）值如圖所示。對10批QFY配方進行了比較和分析，結果表明，QFY保留了其四種中藥成分的主要活性成分，且不同批次的制劑具有良好的重現(xiàn)性。

圖1 QFY配方的HPLC色譜圖

 

2、QFY對肺炎鏈球菌肺炎小鼠模型肺病理和炎性細胞因子的影響

在用s.pn（2.5×108CFU/毫升）感染48小時后，制備小鼠肺組織。通過觀察小鼠肺組織的組織學變化來評價QFY在體內的保護作用。小鼠的代表性肺組織學顯示廣泛的肺炎跡象，觀察到肺組織顏色加深，并伴有間質性炎癥、血管炎、支氣管炎和水腫。肺葉充血、腫脹，并有嗜中性粒細胞浸潤的跡象。QFY治療后，肺組織出血和腫脹減少。表明QFY處理的小鼠預防了S.pn誘導的肺部炎癥損傷。接下來測量了BALF的炎癥細胞因子水平，以研究肺炎鏈球菌感染對肺部炎癥的影響以及QFY對肺炎鏈球菌誘導的肺炎的保護作用。TNF-α、IL-1β和IL-1β的炎性細胞因子水平增加，因此，上述數(shù)據(jù)表明，肺炎鏈球菌感染誘導肺部炎癥被QFY療法逆轉。

圖2 QFY預防了感染小鼠的肺炎鏈球菌誘導的肺部炎癥損傷

 

3、QFY治療改變S.pn感染小鼠的蛋白表達

為了揭示QFY減輕肺炎鏈球菌誘導的小鼠肺炎的精確分子機制，使用4D無標記定量蛋白質組學分析來檢測QFY處理的肺組織中差異表達的蛋白質。在S.pn組與對照組中鑒定出655個差異蛋白質，其中433個蛋白上調，222個蛋白下調。GO功能注釋結果表明，免疫和細胞因子產(chǎn)生的調節(jié)、對細菌的反應和防御反應注釋到。與S.pn感染組相比，QFY處理組中有345種蛋白質差異表達。正如預期的那樣，相對于上述其他過程，這些差異表達的蛋白質在病原體感染期間顯著富集。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明QFY顯著逆轉了S.pn誘導的宿主防御和免疫反應的改變。

圖3 組分類和GO功能注釋

 

4、QFY治療通過NOD樣受體和自噬信號通路減輕S.pn誘導的肺炎

為了進一步研究肺炎鏈球菌感染期間的QFY靶和QFY作用機制，進行了基于KEGG的差異表達蛋白的生物學分析。36和13個差異蛋白分別富含NOD樣受體和自噬信號通路。使用蛋白質印跡和免疫組織化學(IHC)，進一步驗證代表性差異表達的蛋白質。NLRP3和NF-κB信號通路共同參與細胞因子的釋放，從而證實了上述信號通路中其他代表性蛋白的參與。自噬已經(jīng)成為病原體入侵期間維持宿主體內平衡的重要過程，mTOR依賴性自噬被抑制，正如在S.pn感染后48小時mTOR磷酸化和p62積聚所證明的那樣。對上述數(shù)據(jù)的證實表明，QFY通過下調NLRP3的水平和糾正有缺陷的自噬來減輕S.pn誘導的肺炎。研究人員推測，即使沒有直接暴露于完整的肺炎鏈球菌，QFY也可能在體內發(fā)揮類似的保護作用，這促使作者通過研究PLY處理的MH-S細胞作為體外肺炎模型來檢驗這一假設。

圖4 QFY改變NOD樣受體和自噬信號通路的表達 圖5 對照組、S.pn組和S.pn+QFY組（0.42g/kg）小鼠肺組織中與NLRP3組分、自噬途徑相關的關鍵蛋白表達的驗證（A，B）和IHC（C，D）

 

5、QFY對PLY誘導的MH-S細胞的影響

為了進一步探索QFY保護性減輕S.pn感染是否與NLRP3下調（以及自噬激活）有關，作者研究了PLY處理的MH-S細胞中關鍵蛋白的表達水平。MH-S細胞用PLY（400 ng/ml）和低劑量（25μg/ml）或高劑量（50μg/ml）和QFY共處理24小時。與體內實驗結果一致，PLY誘導NLRP3、ASC和裂解的casp1蛋白水平的增加，同時檢測到功能失調的自噬。重要的是，據(jù)報道NLRP3和自噬途徑通過相互調節(jié)聯(lián)系在一起，這些觀察啟發(fā)作者進一步探索涉及NLRP3和自噬途徑的雙向調節(jié)機制，并確定QFY靶點。

圖6 蛋白質印跡檢測蛋白表達

 

6、QFY通過下調上游NLRP3\/mTOR途徑激活自噬

越來越多的證據(jù)表明，NLRP3表達的上調依賴于NF-κB通路的激活。同時，NLRP3作為mTOR的結合伴侶，參與抑制自噬的NLRP3-mTOR復合物的形成。作者進行了Spearman相關分析來評估NLRP3途徑蛋白水平和自噬之間的潛在聯(lián)系。有趣的是，在自噬和凋亡之間觀察到了高度顯著的正相關。相反，NLRP3、ASC和caspase-1水平與p-mTOR/mTOR和p62水平顯著正相關，與p-mTOR/mTOR和p62水平顯著負相關，與LC3BII/I和p-ULK/ULK水平相關。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明肺炎的發(fā)展伴隨著自噬的阻斷，NLRP3和自噬途徑彼此負相關。接下來，MH-S細胞對PLY刺激(400ng/ml)的反應通過從6至48小時進行的時間過程實驗進行研究。在感染后6小時，NLRP3和ASC的蛋白表達水平?jīng)]有顯著變化。然而，在持續(xù)感染48小時后，NLRP3和ASC的表達比它們各自的基礎水平增加了3倍多。QFY治療顯著下調了NLRP3途徑成分，也修復了缺陷性自噬�？傊�，QFY抗肺炎鏈球菌作用似乎與通過下調涉及NLRP3/mTOR的上游自噬途徑事件激活自噬有關。

圖7 （A）自噬和NLRP3信號通路的Spearman相關分析。（B）MH-S細胞對PLY刺激（400納克/毫升）的反應通過刺激后6至48小時進行的時間過程實驗進行探索。蛋白質在（C，D）中定量，數(shù)據(jù)以每組（n=3）的平均值±標準差表示，*p<0.05，**與對照組相比p<0.01。 圖8 QFY通過下調上游NLRP3\/mTOR途徑激活自噬

 

研究結論

總之，該結果表明，NLRP3通過結合mTOR抑制自噬，而QFY通過下調NLRP3逆轉感染受損的自噬。這項研究為今后研究QFY和其他中草藥治療肺部感染性疾病的確切靶點和機制提供了理論依據(jù)。