單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄揭示腸道菌群加重脂肪肝

 

非酒精性脂肪肝（NASH）正迅速成為肝移植和肝衰竭的首要原因。肝炎是NASH的關(guān)鍵特征，但參與這一過程的免疫通路尚未充分闡明。B細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。然而，B細(xì)胞在NASH發(fā)病機(jī)制中的作用以及導(dǎo)致它們?cè)诟闻K中激活的潛在機(jī)制尚不清楚。美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)Xavier Revelo教授等研究團(tuán)隊(duì)在Hepatology（IF 17.425）上發(fā)表了一項(xiàng)題為“Microbiota‐driven activation of intrahepatic B cells aggravates NASH through innate and adaptive signaling”的研究，該研究從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組出發(fā)，并結(jié)合腸道菌群的多樣性，運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合，系統(tǒng)闡述腸道微生物群驅(qū)動(dòng)的B細(xì)胞積累和活化會(huì)在NASH進(jìn)展過程中通過先天性和適應(yīng)性免疫機(jī)制導(dǎo)致肝臟炎癥和纖維化。

 研究材料

 

 技術(shù)路線

步驟1：HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟中存在促炎性B細(xì)胞的聚集和活化，而B細(xì)胞缺陷小鼠的肝臟炎癥和纖維化得到改善

步驟2：MyD88是B細(xì)胞在NASH過程中促進(jìn)肝臟炎癥、纖維化和損傷所必需的；

步驟3：NASH中的B細(xì)胞活化受到B細(xì)胞受體信號(hào)，提示B細(xì)胞活化整合了天然免疫和適應(yīng)性免疫機(jī)制;

步驟4：移植NASH患者糞菌增加了受體小鼠肝臟中的B細(xì)胞積累和活化，從而加劇NASH，提示腸道菌群因素驅(qū)動(dòng)了B細(xì)胞在NASH中的致病性。

 

 研究結(jié)果

為了確定肝內(nèi)B細(xì)胞在NASH進(jìn)展中的作用，作者用HFHC飲食誘導(dǎo)小鼠NASH，并分離出免疫細(xì)胞后識(shí)別主要的免疫細(xì)胞群，HFHC組的B細(xì)胞顯著增加。為了評(píng)估B細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)情況，作者發(fā)現(xiàn)分別在丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）和脂多糖（LPS）刺激后，NASH小鼠表達(dá)TNF-α和IL-6的B細(xì)胞數(shù)量增加。同時(shí)，來自NASH小鼠的B細(xì)胞也顯示出細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物 (MHC) I類和II類以及CD86的上調(diào)，這表明活化和抗原呈遞能力增加。以上結(jié)果表明，NASH小鼠中肝內(nèi)B細(xì)胞積累，并釋放促炎細(xì)胞因子以及呈遞抗原的能力增加。
 

圖1 促炎性B細(xì)胞在NASH小鼠的肝臟中積累

 

2. NASH小鼠肝內(nèi)B細(xì)胞顯示促炎基因譜

為了更好地了解NASH如何改變B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜，作者對(duì)來自NCD和HFHC肝臟的免疫細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)24個(gè)CD45⁺免疫細(xì)胞簇。作者主要關(guān)注了B細(xì)胞簇的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)炎癥基因Il1b、S100a8等在HFHC肝臟B細(xì)胞中表達(dá)增加。為了驗(yàn)證單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組對(duì)B細(xì)胞表達(dá)譜的檢測(cè)能力，作者還對(duì)HFHC和NCD小鼠肝臟B細(xì)胞進(jìn)行了常規(guī)RNA-seq，同樣驗(yàn)證了幾個(gè)促炎基因在HFHC肝臟B細(xì)胞中上調(diào)。為了解釋這些數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義，作者使用 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 來檢測(cè)基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)參與炎癥和TLR信號(hào)傳導(dǎo)的上游調(diào)節(jié)因子的激活，以及IL10RA和SOCS1的抑制，并且富集到活躍的炎癥途徑。以上結(jié)果顯示NASH小鼠的B細(xì)胞活化和炎癥表型增加。
 

圖2 肝內(nèi)B細(xì)胞在NASH期間顯示出促炎基因譜

 

3.  B細(xì)胞缺陷可改善NASH

為了確定B細(xì)胞是否在NASH的發(fā)病機(jī)制中起直接作用，作者評(píng)估了HFHC喂養(yǎng)的B細(xì)胞缺陷μMT小鼠的NASH進(jìn)展。HFHC μMT小鼠顯示出NAS評(píng)分較低，且轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，在HFHC μMT小鼠中，促炎基因的表達(dá)顯著降低，B細(xì)胞數(shù)目顯著減少，并且HFHC μMT小鼠纖維化明顯減少，纖維化形成基因表達(dá)降低，而這些變化在NCD WT和NCD μMT小鼠中并未檢測(cè)到，該結(jié)果說明在HFHC喂養(yǎng)后，B細(xì)胞可以引起代謝和炎癥紊亂。
 

圖3 B 細(xì)胞缺乏可改善NASH期間的炎癥和纖維化

 

4.  促炎基因MyD88介導(dǎo)NASH中B細(xì)胞的促炎功能

RNA-seq分析確定MyD88是HFHC小鼠肝B細(xì)胞中促炎基因的上游調(diào)節(jié)因子，為了研究B細(xì)胞固有的MyD88信號(hào)傳導(dǎo)是否影響NASH進(jìn)展，作者構(gòu)建了B細(xì)胞特異性缺失 MyD88 (B-MYD) 的小鼠，HFHC喂養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)B-MYD HFHC小鼠NAS評(píng)分較低。雖然B-MYD HFHC和WT HFHC小鼠之間的總數(shù)和亞群免疫細(xì)胞群沒有差異，但B-MYD HFHC小鼠的肝內(nèi)B細(xì)胞MHC-I和MHC-II減少，這表明TLR介導(dǎo)的激活降低了抗原的呈遞能力。以上結(jié)果表明，B細(xì)胞需要MyD88來促進(jìn)NASH的肝臟炎癥、纖維化和損傷。
 

圖4 MyD88介導(dǎo)NASH中B細(xì)胞的炎癥功能

 

5.  BCR刺激激活肝內(nèi)B細(xì)胞

BCR與抗原結(jié)合產(chǎn)生的激活信號(hào)是B細(xì)胞活化的第一信號(hào)，接下來作者探究了在NASH過程中肝內(nèi)B細(xì)胞的激活是否與BCR信號(hào)有關(guān)，因BCR信號(hào)傳導(dǎo)在Nur77基因的控制下誘導(dǎo)綠色熒光蛋白 (GFP) 表達(dá)，作者給Nur77-GFP小鼠喂食NCD或HFHC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFHC Nur77-GFP小鼠的GFP+肝內(nèi)B細(xì)胞的頻率和數(shù)量顯著增加，表明在NASH期間的激活涉及肝臟中的BCR信號(hào)。該結(jié)果表明，NASH中，B細(xì)胞的活化受到BCR信號(hào)刺激。