慢病毒大規(guī)模制備下游工藝解決方案

圖1：慢病毒作用機制（來源和元生物）
 

慢病毒的英文是Lentivirus，它的命名有兩層意思，一方面Lenti-在拉丁文中有慢的意思；另一方面慢病毒感染患者早期很難觀察，大多都會經(jīng)歷一個長達數(shù)年的潛伏期，之后會緩慢發(fā)病，因此這些病原微生物被稱之為慢病毒。它是逆轉(zhuǎn)錄病毒科下的一個屬，其主要包括8種能夠感染人和脊椎動物的病毒，原發(fā)感染的細胞以巨噬細胞和淋巴細胞為主，最終導致感染個體發(fā)病。慢病毒的基因組都很復雜，編碼一系列不同于其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的調(diào)控蛋白，這使得它們具有獨特的調(diào)控途徑和病毒持久性機制。

 

逆轉(zhuǎn)錄病毒家族包括致癌病毒（RNA腫瘤病毒）、狼瘡病毒以及慢病毒，這三個子家族的成員都能感染人類。慢病毒通常與免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病有關，如人類免疫缺陷病毒（HIV）會導致艾滋病，HTLV和HIV會導致神經(jīng)障礙。

 

1904年第一個慢病毒被分離出來的，它是從一匹得了溶血性貧血的馬中得到，所以被命名為馬傳染性貧血病毒（EIAV）。從那時起，相關的慢病毒陸續(xù)從其他的物種中被分離，如猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、山羊關節(jié)炎腦炎病毒（CAEV）以及靈長類免疫缺陷病毒（SIV）等。

 

慢病毒載體能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細胞、肝細胞、心肌細胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型原代細胞和大部分細胞系。

 

慢病毒的感染具有整合特性，能夠?qū)⑼庠椿�因有效地整合到宿主染色體上，因而可以達到持久性表達，從而構建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，體外進行細胞功能學實驗，包括細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等研究。穩(wěn)定表達目的基因的腫瘤細胞株還可以進一步構建腫瘤動物模型，進行體內(nèi)基因功能驗證，藥效藥代，活體成像等檢測，進一步研究體內(nèi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移及藥物治療的效果。

常見MOI列表

MOI 是multiplicity of infection 的縮寫，即感染復數(shù)，其含義是感染時病毒與細胞的數(shù)量比值，一般以實驗中某個細胞，感染達到80%，定義為這個細胞的MOI值，即病毒量與細胞數(shù)的比值；加的病毒量(μl)=細胞數(shù)×MOI/滴度(…/ml) ×1000（注：本段內(nèi)容選自和元生物管網(wǎng)）

 

慢病毒雖然屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一種，但其結構和基因組的復雜程度遠超其他逆轉(zhuǎn)錄病毒。這也使得慢病毒具有獨特的整合機制和病毒感染持久性。

 

慢病毒整體大小約100nm，在病毒載體中屬于體積較大類型。其包裝容量一般在4.5-5kb左右，能夠滿足一般的細胞治療需求。

 

慢病毒檢測方法
在293T細胞株中對純化的慢病毒進行滴度測定，常用有4種方法進行慢病毒滴度測定，分別是： 
➤通過ELISA對病毒顆粒中的p24蛋白進行檢測;
➤通過定量PCR對病毒顆粒的RNA進行檢查;
➤通過定量PCR對整合到基因組DNA中的病毒序列進行檢測；
➤通過FACS對熒光蛋白的表達水平進行檢測。

 

但前兩種方法并不能區(qū)分病毒顆粒是否有活性，因此測定所得的滴度往往比后兩種方法高一至兩個數(shù)量級。后兩種方法測定的是有效的病毒滴度，因此更有意義。由于并非所有的病毒載體中都含有熒光蛋白，此外，熒光蛋白的表達有時候還受啟動子及表達的目的基因影響，因此過定量PCR對整合到基因組DNA中的病毒序列進行檢測是最佳方法。

 

 

1.澄清的病毒溶液經(jīng)核酸酶孵育，核酸酶將宿主細胞核酸講降解成小片段，且降低粘度。

2.核酸酶處理后的病毒溶液用300-750KD的膜組件進行切向流過濾伴隨置換緩沖液，調(diào)整病毒粒子的濃度且使病毒溶液適用于下游分離純化。

3.澄清好的病毒溶液用高剛性瓊脂糖微球陰離子交換介質(zhì)Q Large Scale HP吸附洗脫模式純化并濃縮。

4.經(jīng)陰離子交換（Q Large Scale HP）純化后病毒溶液在用Seplife Suncore 700多模式層析介質(zhì)進行粗純，小于700KD的痕量HCP,HCD等物質(zhì)進入多模式介質(zhì)的活性內(nèi)核區(qū)域，和介質(zhì)以靜電力，疏水作用，范德華力等結合，而慢病毒由于分子尺寸大，被排阻在介質(zhì)的惰性層以外流穿而過，從而實現(xiàn)分離。同時也可用凝膠過濾層析Seplife 4FF流穿模式去除痕量的雜質(zhì)。

5.層析純化后，在經(jīng)超濾過程調(diào)整病毒粒子濃度及置換后續(xù)工序適合的緩沖液。

6.最后用0.22um的膜組件除菌過濾。更多關于慢病毒下游工藝解決方案的信息請聯(lián)系蘇州藍曉生物。

 
圖：殼層技術多模式層析介質(zhì)結構示意圖（藍曉科技）