單細(xì)胞代謝組工作流程及應(yīng)用--解碼細(xì)胞代謝異質(zhì)性

傳統(tǒng)代謝組學(xué)研究通常需要每個(gè)樣品有大量的細(xì)胞，多細(xì)胞樣品可以充分檢測化學(xué)成分，但細(xì)胞的異質(zhì)性被忽略。單個(gè)細(xì)胞之間的差異可能是遺傳，表觀遺傳，發(fā)育和環(huán)境因素的結(jié)果。即使是克隆或等基因培養(yǎng)物中的細(xì)胞也可能由于隨機(jī)生物學(xué)過程而在表型上有所不同。

單細(xì)胞代謝組學(xué)（SCM）目前是在細(xì)胞水平上進(jìn)行高通量代謝物分析的最強(qiáng)大的工具之一，其在確定單個(gè)細(xì)胞的代謝譜方面的能力使其非常適合解碼細(xì)胞代謝層面的異質(zhì)性，此外，在細(xì)胞群落內(nèi)的細(xì)胞類型鑒定和分化方面也具有巨大的潛力。隨著各種設(shè)備和技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞代謝分析已可用于各種生物樣品。許多領(lǐng)域都采用了這種前沿的分析工具，并產(chǎn)生了富有成效的研究成果。
 
單細(xì)胞代謝組學(xué)工作流程
 
典型的單細(xì)胞代謝組學(xué)工作流程包括樣本收集、樣本制備（獲得單個(gè)細(xì)胞或其細(xì)胞內(nèi)容物）、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析（圖1）。
1）樣本制備方法
常用的樣品制備方法包括熒光活化細(xì)胞分選（FACS）、微流控陣列以及通過原子力顯微鏡（AFM）探針直接可視化和穿透/提取。前兩種方法保留了整個(gè)細(xì)胞的原始形態(tài)，而最后一種方法僅將細(xì)胞代謝物保留在探針中。對于全細(xì)胞樣品，超聲處理可提高檢測靈敏度，而從探針直接輸送到質(zhì)譜儀的干擾最小。
2）單細(xì)胞淬滅
獲得單細(xì)胞后，應(yīng)立即使用有機(jī)酸或初級溶劑來淬滅細(xì)胞代謝，使酶變性，防止代謝物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。最常見的一種淬滅方法是使用液氮速凍，以停止細(xì)胞代謝并促進(jìn)細(xì)胞裂解。具有易操作，不需要額外添加試劑，并且與大多數(shù)MS方法兼容的優(yōu)點(diǎn)。有機(jī)溶劑也常用于細(xì)胞代謝淬滅。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是所用的有機(jī)溶劑也有助于代謝物的提取，其中基于甲醇的淬滅方法是迄今為止最普遍和有效的淬滅策略。
3）數(shù)據(jù)采集
在SCM的所有檢測方法中，基于MS的技術(shù)脫穎而出，主要包括電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-MS）、二次離子質(zhì)譜（SIMS）技術(shù)。
a. ESI-MS   一種廣泛用于單細(xì)胞代謝分析的技術(shù)，通常是將樣品從探針或毛細(xì)管直接輸送到質(zhì)譜儀，只需較少的預(yù)處理過程。由于在環(huán)境條件下電離，ESI-MS可防止樣品破裂。因此，它被廣泛用于活的單細(xì)胞代謝分析。但其具有相對較低的分辨率和低通量的局限性，使其不適合系統(tǒng)生物學(xué)研究。目前可以通過將ESI-MS與毛細(xì)管電泳（CE）聯(lián)合使用以及基于液滴的微萃取與ESI-MS相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)高分辨率和高通量檢測。因此，ESI-MS在單細(xì)胞代謝研究中具有更廣泛的應(yīng)用潛力。
b. MALDI-MS   單細(xì)胞代謝分析的常用技術(shù)之一，通常是將樣品與基質(zhì)混合，然后使用紫外激光束在真空下進(jìn)行照射，電離和加速的分析物進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測分析。有文獻(xiàn)報(bào)道MALDI-MS的高通量能夠?qū)��?xì)胞亞型進(jìn)行分類并檢測細(xì)胞群中的單個(gè)細(xì)胞，也被用于揭示單細(xì)胞生物的種群內(nèi)異質(zhì)性研究。
c. SIMS   一種相對較新的技術(shù)，用于SCM的超高分辨率（<100nm-1μm）研究，將初級脈沖離子束射向樣品表面，并使用質(zhì)譜儀測量噴射的二級離子，其超高分辨率使其適用于分析亞細(xì)胞中的代謝物。由于強(qiáng)初級離子劑量，它也可能對較大的有機(jī)分子造成損害。此外，SIMS不支持同時(shí)進(jìn)行全掃描和MS / MS分析，并且通量較低，但SIMS仍然是目前最靈敏的單細(xì)胞代謝分析方法。
 
基于上述檢測方法，目前在SCM研究中已經(jīng)鑒定出大量的代謝物。這些代謝物包括氨基酸、磷脂、三羧酸（TCA）循環(huán)中間體、核苷酸、脂肪酸和能量代謝物等。  
 單細(xì)胞代謝組學(xué)應(yīng)用

作為一種不斷發(fā)展且強(qiáng)大的分析工具，SCM已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。如在淡水和海洋系統(tǒng)中廣泛發(fā)現(xiàn)形成多物種群落的不同微藻的生理狀態(tài)、深入了解脊椎動物胚胎發(fā)生早期單細(xì)胞代謝異質(zhì)性的形成等，下面重點(diǎn)介紹下SCM在植物學(xué)、神經(jīng)學(xué)和腫瘤學(xué)中的應(yīng)用（圖2）。
1、植物領(lǐng)域
SCM在植物學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用，并取得了重要的研究成果。它為植物細(xì)胞類型和器官的鑒定和代謝分析提供了機(jī)會。單細(xì)胞代謝組學(xué)進(jìn)行精確代謝分析的能力有助于提供獨(dú)特植物功能和有利特征的解釋和機(jī)制，這將極大地有助于基于這些功能和特征的應(yīng)用開發(fā)，例如創(chuàng)造更適應(yīng)的作物品種或更有效地提取所需的生物合成化合物。除了細(xì)胞和器官代謝分析，SCM也是空間代謝分析的有力工具�？傊�，考慮到植物學(xué)中物種、組織和細(xì)胞類型的巨大多樣性，在追求更高分辨率的植物研究趨勢中，SCM已被證明是解碼這種異質(zhì)性的強(qiáng)大工具。SCM在植物研究中的進(jìn)展可以進(jìn)一步有利于實(shí)驗(yàn)處理的評估，對有利植物特征的理解，植物發(fā)育生物學(xué)模型的構(gòu)建以及植物衍生產(chǎn)品的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
2、神經(jīng)領(lǐng)域
神經(jīng)元通常比其他正常細(xì)胞大，并且具有非常詳細(xì)的亞型，疾病或信號引起的神經(jīng)系統(tǒng)變化通常反映在單個(gè)細(xì)胞中。因此，SCM在神經(jīng)學(xué)研究中的代謝分析和異質(zhì)性評估中至關(guān)重要且有價(jià)值。如Do等人報(bào)道脂質(zhì)和其他代謝物的單細(xì)胞分析能有效地對神經(jīng)元細(xì)胞的群體和亞群進(jìn)行分類，有力地支持了單細(xì)胞代謝組學(xué)在破譯神經(jīng)元細(xì)胞異質(zhì)性方面的力量，這提供了神經(jīng)細(xì)胞類型之間的更準(zhǔn)確的區(qū)分，并確定了神經(jīng)系統(tǒng)中不同細(xì)胞類型的特定功能和不同的內(nèi)部細(xì)胞機(jī)制。
3、腫瘤領(lǐng)域
作為眾所周知的腫瘤特征，不同腫瘤和腫瘤亞型之間的異質(zhì)性長期以來一直對有效治療構(gòu)成巨大的挑戰(zhàn)。因此，SCM在識別腫瘤類型/亞型方面的潛力可以顯著提高腫瘤治療效率并促進(jìn)個(gè)性化治療策略的發(fā)展。如一項(xiàng)研究報(bào)道了使用單細(xì)胞代謝數(shù)據(jù)成功區(qū)分乳腺癌亞型，F(xiàn)ang等人的一項(xiàng)研究表明，甘露糖作為興奮劑可以在單細(xì)胞水平上有效改善骨肉瘤細(xì)胞與正常人成骨細(xì)胞的代謝鑒別。總之，SCM是檢測、識別和區(qū)分特定腫瘤細(xì)胞類型的強(qiáng)大工具，可以顯著有益于腫瘤診斷，并針對不同的腫瘤細(xì)胞類型進(jìn)行精確有效的治療，也可以促進(jìn)未來針對特定癌癥類型的治療研究。
   
總結(jié)：
獲取單細(xì)胞水平的代謝數(shù)據(jù)具有很多挑戰(zhàn)，包括一些重要代謝物的絕對代謝物濃度較低，無法像RNA或DNA那樣擴(kuò)增代謝產(chǎn)物，代謝物的快速轉(zhuǎn)換，以及每個(gè)細(xì)胞代謝產(chǎn)物濃度的巨大差異。然而，目前已經(jīng)開發(fā)出有效的技術(shù)，在單細(xì)胞水平上進(jìn)行高靈敏、高通量的代謝組學(xué)分析。隨著這些技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)和創(chuàng)新，SCM在多個(gè)領(lǐng)域開展單細(xì)胞分辨率研究方面具有巨大的潛力，并得到了大量研究結(jié)果的支持。SCM具有獨(dú)特的識別和區(qū)分具有不同代謝特征的單個(gè)細(xì)胞的非凡能力，已經(jīng)幫助解決了以前由于無法單獨(dú)分析來自同一器官或集群的細(xì)胞而引起的問題。它使我們能夠了解植物的特征，解碼不同神經(jīng)細(xì)胞的特征，對抗腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性等等。為了對我們周圍的世界進(jìn)行更詳細(xì)和具體的分析，SCM無疑是我們目前擁有的最強(qiáng)大的工具之一。
 
參考文獻(xiàn)：Guo S, Zhang C, Le A. The limitless applications of single-cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 2021 Oct;71:115-122.