單細胞解析H3-K27M突變驅(qū)動膠質(zhì)瘤細胞狀態(tài)和空間景觀

【期刊】：Nature genetics
【影響因子】：41.307
2022年12月，美國麻省理工大學Ilon Liu和Mariella G. Filbin教授通過單細胞測序建立不同年齡組H3-K27M突變驅(qū)動的彌漫性中線膠質(zhì)瘤(DMG)患者中線位置圖譜，描述了年齡和空間位置如何根據(jù)共同的驅(qū)動基因突變塑造膠質(zhì)瘤細胞的內(nèi)在和外在特征。

01用單細胞技術(shù)解決了什么問題？
作者利用單細胞多組學和空間轉(zhuǎn)錄組學方法分析H3-K27M DMG的擴展隊列，確定了年齡和解剖位置如何根據(jù)共同的驅(qū)動基因突變塑造膠質(zhì)瘤細胞的內(nèi)在和外在特征，這些特征共同決定了常見的K27M突變以及膠質(zhì)瘤空間和細胞結(jié)構(gòu)的變化。
02實驗亮點
通過單細胞測序配合其它研究手段解釋了與年齡相關(guān)的微環(huán)境因素如何差異地塑造腫瘤細胞狀態(tài)。
03臨床意義
作者提供了跨空間和時間的H3-K27M DMG細胞異質(zhì)性的廣泛資源，有助于描繪特定時空環(huán)境下的細胞特性和微環(huán)境生態(tài)位之間的多方面相互作用，以設(shè)計合理的建模研究和治療框架。

研究背景
由組蛋白3賴氨酸27至蛋氨酸(H3-K27M)突變驅(qū)動的彌漫性中線膠質(zhì)瘤(DMG)是最致命的腦腫瘤之一，發(fā)病率在年幼兒童腦干腦橋區(qū)域達到峰值。有研究表明腦橋中的前體細胞和早期神經(jīng)發(fā)育窗口作為K27M突變介導的膠質(zhì)瘤發(fā)生的時空相關(guān)性。從細胞內(nèi)在上講，K27M突變導致廣泛的表觀遺傳失調(diào)，從而將發(fā)育受限的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)橹铝鲂愿杉毎麪顟B(tài)。然而，對于不同中線位置(如丘腦、腦橋或脊髓)以及不同年齡組和呈現(xiàn)出不同形態(tài)特征的H3-K27M DMG是否具有相似的細胞組成還不完全清楚。年齡和區(qū)域特異性組織環(huán)境與H3-K27M DMG的不同臨床解剖學特征之間的相互作用及其對腫瘤病理學的貢獻仍未得到探索。因此，本研究利用單細胞多組學和空間轉(zhuǎn)錄組學方法來分析，進一步解析了H3-K27M DMG細胞群的空間組織，并鑒定了有絲分裂的少突膠質(zhì)細胞譜系生態(tài)位。 研究結(jié)果
1、跨時空的H3-K27M DMG細胞圖譜構(gòu)建
作者對50個H3-K27M突變患者腫瘤進行了多組學分析，取腦橋、丘腦、下腦干和脊柱進行scRNA-seq/snRNA-seq(圖1a,b)。作者通過CNA分析以及UMAP圖展示了H3-K27M DMG細胞組成和按年齡和位置分層的細胞亞群的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性(圖1c-d)。
2、不同時空背景下的H3-K27M DMG細胞組成
通過對腫瘤細胞進一步細分得到OPC-like、AC-like、OC-like、Cycling、MES-like(圖2a)。其中OPC-like細胞普遍存在于所有腫瘤中，與年齡或位置無關(guān)，而MES-like則首次在H3-K27M DMG被檢測到(圖2a-d)。相同位置和年齡組但不同基因型的原發(fā)性膠質(zhì)瘤的比較支持K27M突變的直接細胞內(nèi)在效應(yīng)，使腫瘤細胞偏向膠質(zhì)/OPC-like而非neuron-like。
利用SCENIC發(fā)現(xiàn)了在正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞中已知的關(guān)鍵基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GRN)在H3-K27M DMG腫瘤細胞對應(yīng)物中同樣具有活性，突出了正常發(fā)育的神經(jīng)膠質(zhì)和腫瘤細胞的相似性(圖2e)。通過比較腫瘤位置和年齡組的細胞組成發(fā)現(xiàn)，MES-like在成人腫瘤中顯著富集，又通過RNA原位雜交進行驗證(圖2f，2h)，并觀察到MES-like特征與年齡的關(guān)聯(lián)(圖2i)，這表明非編碼突變和/或非遺傳決定因素可能是觀察到的年齡特異性的基礎(chǔ)。因此，H3-K27M DMG偏向于獨立于年齡或中線位置的OPC-like細胞身份，這表明K27M癌組蛋白突變本身的細胞內(nèi)在效應(yīng)。
3、OPC-like亞群的位置特異性
通過對OPC-like無監(jiān)督聚類得到3亞群，OPC-like-1表達經(jīng)典OPC的marker基因，相比之下，OPC-like-2和OPC-like-3細胞表現(xiàn)出前OPC分化狀態(tài)(圖3a-f)。使用scRNA-seq數(shù)據(jù)集對OPC-like亞群特異性GRN的分析發(fā)現(xiàn)，SHOX2和OTX2等TF在OPC-like-1細胞中具有最特異性的活性(圖3g)。OPC-like-2細胞特有的GRN包括Notch信號調(diào)節(jié)因子HES6以及HOX家族的多個圖案化TF，OPC-like-3細胞的GRN特征與AP-1 TF家族相關(guān)(圖3g)。比較OPC-like亞群在時空分層的來源，腦橋中前OPC-like細胞顯著富集，OPC-like-1細胞富集在丘腦腫瘤中(圖3h)。
4、H3-K27M DMG細胞群的開放染色質(zhì)景觀
作者通過8個腫瘤的snATAC-seq來探測單核可及染色質(zhì)譜，以補充和驗證單細胞轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果證明snATAC-seq與scRNA-seq衍生的細胞群基本一致，包括AC-like細胞(圖4a,b)。通過將snATAC-seq衍生的可訪問染色質(zhì)區(qū)域/峰與scRNA-seq相關(guān)聯(lián)，測量其最接近相關(guān)基因的表達水平，確定了順式調(diào)節(jié)DNA元件(CRE)及其靶基因的13632個潛在的峰-基因鏈接(圖4c)。其中，287個基因表現(xiàn)出超過8個(前5%)相關(guān)的CRE，表示高調(diào)控位點復雜性，是關(guān)鍵譜系標記基因的決定因素(圖4d，e)。OPC/OC-like細胞特異性預測染色質(zhì)(GPCs)相關(guān)的基因，表明對普遍存在的H3-K27M DMG的少突膠質(zhì)譜系進行高度合作的調(diào)節(jié)(圖4e)，將候選GPC與H3-K27ac ChIP-seq衍生的H3-K27M原發(fā)性腫瘤的超級增強子譜疊加,證明了GPC與H3-K27M DMG超級增強子調(diào)節(jié)基因的顯著重疊(圖4f)。進一步發(fā)現(xiàn)含有SOX8 TF結(jié)合位點的16個CRE相連，進一步預測其在OPC-like細胞中具有差異活性(圖4g,h)。所有腫瘤細胞狀態(tài)的GPC的CRE中基因表達，染色質(zhì)可及性和細胞狀態(tài)特異性TF富集之間的相互依賴性，例如AC樣標記基因ITPKB(圖4i)。這些證實了染色質(zhì)調(diào)控和基因表達在多個層面上的緊密交織和細胞狀態(tài)特異性。
5、H3-K27M DMG中的年齡特異性骨髓細胞景觀
本研究通過基因集打分將TAM分為小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞(圖5a–c)，不同年齡組的小膠質(zhì)細胞與巨噬細胞比例的比較顯示，兒童DMG中的小膠質(zhì)細胞發(fā)生率較高，而成人DMG中巨噬細胞的發(fā)生率較高(圖5d)，腫瘤位置似乎不影響這些比例。在本研究的隊列中，與兒童H3-K27M DMG相比，成人MES-like細胞的顯著富集，并在成人TAM中檢測到更高的OSM表達及相應(yīng)的受體OSMR(圖5e，f)，表明免疫介導途徑的參與誘導成人腫瘤中的MES-like表型。此外，與兒童TAM相比，觀察到成人MES-like標記基因在間充質(zhì)富集的膠質(zhì)瘤中表達增加(圖5g)。通過分析正常小鼠腦骨髓細胞圖譜中跨年齡的基因表達，觀察到配體OSM和間充質(zhì)標志基因隨著年齡的增長而增加(圖5h)，表明H3-K27M DMG腫瘤MES-like狀態(tài)隨年齡的增長與腦髓區(qū)室的變化有關(guān)，這種變化在正常發(fā)育和衰老過程中也發(fā)生。
6、繪制H3-K27M DMG的單細胞空間結(jié)構(gòu)圖
在16個患者H3-K27M DMG組織切片中使用一組從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中收集的 116個細胞類型特異性組合標記基因(圖6a-c)。通過原位測序(pciSeq)的概率細胞分型分析了空間細胞狀態(tài)組成，觀察到AC-like細胞構(gòu)成了主要的惡性細胞區(qū)室(圖6c)。相對于兒童腫瘤，成人H3-K27M DMG切片具有更高比例的MES-like腫瘤細胞(圖6d)。惡性細胞鄰域的全局分析表明，OPC-like/Cycling 和 OC-like細胞的共定位更高(圖6e)，通過多重免疫熒光(IF)成像驗證增殖OPC-like和OC-like細胞的首選為有絲分裂生態(tài)位，被更分化的，不增殖的AC-like細胞包圍(圖6f)。通過計算聚類系數(shù)發(fā)現(xiàn)AC-like細胞，非惡性星形膠質(zhì)細胞和TAMs與其他細胞類型/狀態(tài)聚集的最高趨勢，暗示它們更彌漫分布，而不是局限于有限的空間區(qū)室(圖6g)。因此，在天然腫瘤組織內(nèi)解析了scRNA-seq定義的H3-K27M DMG細胞群的空間結(jié)構(gòu)，特別是表明存在有絲分裂干樣生態(tài)位，其中少突膠質(zhì)細胞譜系的H3-K27M腫瘤細胞(OPC-like和OC-like癌細胞)共定位。
本研究提供了跨空間和時間的H3-K27M DMG細胞異質(zhì)性的廣泛資源，有助于描繪時空環(huán)境特定細胞特性和微環(huán)境生態(tài)位之間的多方面相互作用，以設(shè)計合理的建模研究和治療框架，為這種致命膠質(zhì)瘤的不同臨床解剖學群體量身定制。

參考文獻
Liu, I., Jiang, L., Samuelsson, E.R. et al. The landscape of tumor cell states and spatial organization in H3-K27M mutant diffuse midline glioma across age and location. Nat Genet (2022).
https://doi.org/10.1038/s41588-022-01236-3.