​糖基化蛋白的分離純化

蛋白質(zhì)糖基化
蛋白糖基化的兩個(gè)主要類型是N-糖基化（聚糖結(jié)合到天冬酰胺）和O-糖基化（聚糖結(jié)合到絲氨酸或蘇氨酸），糖基化修飾的聚糖種類繁多。一般來說，N-多聚糖附著在由Asn-X-Ser/Thr組成的特定氨基酸序列基序上，X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。O-多聚糖與絲氨酸或蘇氨酸相連，沒有任何特定的氨基酸序列基序，此外，N-聚糖有一個(gè)共同的核心結(jié)構(gòu)，由GlcNAc2Man3組成，而O-聚糖則有多個(gè)核心結(jié)構(gòu)。蛋白糖基化分析的目的是確定聚糖基，被修飾的蛋白質(zhì)，或結(jié)合的位點(diǎn)。在一般情況下，糖基化分析，可以使用三種不同的方法，概述如圖1 A：化學(xué)或酶解后對(duì)釋放的聚糖本身的分析，胰蛋白酶消化后對(duì)糖肽的定性，或完整的糖蛋白中對(duì)聚糖的定性。
A, 糖基化的質(zhì)譜測(cè)定有三種常用方法：檢測(cè)完整的蛋白多糖，檢測(cè)胰蛋白酶消化的產(chǎn)物，或檢測(cè)釋放的和分離的聚糖。 B, LC-MS檢測(cè)小牛血清胎球蛋白，表明 Cc5細(xì)菌培養(yǎng)的（下圖）相比于未經(jīng)處理的（上圖）胎球蛋白的糖基化變化。用胰蛋白酶消化胎球蛋白，然后用LC-MS分析。藍(lán)色正方形代表GlcNAc，紅色和綠色的圓形代表Man和Gal, 橙色鉆石形代表
 
糖基化蛋白的鑒定方法
聚糖分析，可以用質(zhì)譜分析，有時(shí)并用高效液相色譜法。糖蛋白首先經(jīng)過酶（肽N糖苷酶A或F）或化學(xué)（hydazinolysis）方法釋放糖基。然后LC/MS直接分析釋放的低聚糖�；蛘�，酶或化學(xué)裂解產(chǎn)生可以還原型末端被標(biāo)上熒光標(biāo)記，然后通過一些可能的HPLC方法，如親水作用色譜，分析熒光標(biāo)記的聚糖。
 雖然上述方法能提供特定聚糖的信息，但是這些信息不能鑒定出帶有特定修飾的蛋白質(zhì)，也不能鑒定出糖基化的結(jié)合位點(diǎn)。為了獲得此信息，就要進(jìn)行蛋白內(nèi)切酶裂解（如胰蛋白酶消化），LC/MS或HILIC-MS/MS分析糖肽。這種方法提供的信息是帶有特定聚糖分子的所有蛋白質(zhì)，或者是目標(biāo)蛋白中聚糖的結(jié)合位點(diǎn) [20] 。例如，圖6B，是 Cc5細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)特定胎球蛋白殘基的糖基化狀態(tài)的影響，分析方法是胰蛋白酶消化后，用LC-MS檢測(cè)。
 最后，對(duì)于有些糖肽，完整蛋白的質(zhì)譜分析可以提供蛋白質(zhì)的身份鑒定及其糖基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)。然而，這種方法取決于糖肽的生化特性，提供的數(shù)據(jù)的分辨率水平通常低于前述兩種方法。

糖基化蛋白的分離純化
由于硼酸反應(yīng)的專一性，硼酸鹽親和材料近年來受到越來越多的關(guān)注。已證實(shí)硼酸鹽親和材料可以有效分離包括糖蛋白在內(nèi)的含順式二羥基結(jié)構(gòu)的化合物。硼酸分子與糖鏈上的順式二羥基結(jié)構(gòu)在堿性條件下形成環(huán)酯，該生成物在酸性條件下容易水解，反應(yīng)原理如圖2所示�；�于該可逆反應(yīng)，可利用硼酸鹽親和材料選擇性檢測(cè)分離富集糖基化蛋白。