項(xiàng)目文章 :單細(xì)胞測(cè)序揭示SUMO1調(diào)控心肌梗死后的心臟修復(fù)機(jī)制

2022年11月27日，天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)利用新格元單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)揭示了SUMO1基于細(xì)胞異質(zhì)性調(diào)控心肌梗死后的心臟修復(fù)機(jī)制。該研究成果即將發(fā)表在《Journal of Pharmaceutical Analysis》期刊上。該論文第一署名單位為天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，劉志浩為第一作者，樊官偉和邊希云教授為共同通訊作者。
 
研究背景
SUMO化修飾是一種動(dòng)態(tài)的翻譯后修飾，可維持心臟功能，并可保護(hù)心臟壓力過(guò)載的肥厚反應(yīng)。然而，心肌梗死(MI)后SUMO化修飾的功能以及心臟細(xì)胞對(duì)SUMO1缺陷反應(yīng)的分子機(jī)制尚未確定。在本研究中，作者構(gòu)建了SUMO1-/-小鼠模型，通過(guò)單細(xì)胞核RNA(snRNA-seq)測(cè)序揭示了SUMO1在調(diào)節(jié)心臟細(xì)胞中的不同作用。
   
研究結(jié)果
1.SUMO1參與MI后的病理過(guò)程
為了確定SUMO1是否與MI后的修復(fù)反應(yīng)有關(guān)，作者采用免疫組化檢測(cè)了MI后小鼠心臟切片中SUMO1的水平，MI后7天，梗死區(qū)SUMO1水平明顯升高(圖1A)，提示SUMO1參與MI后心臟病理修復(fù)過(guò)程。然而邊界區(qū)的SUMO1水平明顯降低(圖1B)。
為了進(jìn)一步探索SUMO1對(duì)MI后心功能的影響，在MI后7天，對(duì)SUMO1-/-小鼠和同批次WT小鼠進(jìn)行了檢測(cè)。MI后，與WT小鼠相比，SUMO1-/-小鼠在射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短分?jǐn)?shù)(FS)方面明顯表現(xiàn)出更差的心功能(圖1C-E)。染色結(jié)果也顯示， SUMO1-/-小鼠梗死面積更大，心室不良反應(yīng)更嚴(yán)重(圖1F和G)。這些結(jié)果表明，心臟SUMO1缺失加重了MI誘導(dǎo)的不良心臟重塑和收縮功能障礙。
2.snRNA-seq鑒定四種主要心臟細(xì)胞群 
MI的病理過(guò)程涉及多種細(xì)胞類(lèi)型。作者利用snRNA-seq在假手術(shù)或MI后第7天鑒定WT和SUMO1-/-小鼠心臟的細(xì)胞群(圖2A)。經(jīng)過(guò)篩選和質(zhì)控，共保留103,806個(gè)細(xì)胞，根據(jù)marker基因分為心肌細(xì)胞(CMs)、內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)、成纖維細(xì)胞(FBs)和單核吞噬細(xì)胞(MPs)四種細(xì)胞類(lèi)型 (圖2B-E)。這四種細(xì)胞的豐度在MI后發(fā)生了改變(圖2F)。例如，MI后CMs明顯丟失，且SUMO1-/-小鼠丟失比例高于WT小鼠，提示SUMO1缺失導(dǎo)致缺血缺氧損傷時(shí)CM代償能力下降。這些結(jié)果表明，SUMO1對(duì)MI后不同類(lèi)型的心臟細(xì)胞具有不同的調(diào)節(jié)作用。
3.SUMO1缺失導(dǎo)致MI后Nppa+Nppb+Ankrd1+CM簇比例上升
CMs是決定MI后心臟命運(yùn)的主要細(xì)胞類(lèi)型，作者將來(lái)自所有樣本的52,611個(gè)CM聚類(lèi)為6個(gè)不同的CM亞群 (圖3A)。CM-3簇特異性表達(dá)多種應(yīng)激相關(guān)基因(Nppa, Nppb, Ankrd1)，這些基因是心臟病預(yù)后不良的標(biāo)志，CM-3簇比例的增加可能表明損傷加重 (圖3D和E)。此外，SUMO1-/-小鼠MI后心房鈉尿肽(ANP)和腦鈉肽(BNP)mRNA水平均高于WT小鼠(圖3F)。ANP和BNP水平與局部壁面應(yīng)力呈正相關(guān)，會(huì)導(dǎo)致更大的梗死面積。通過(guò)免疫熒光染色，作者發(fā)現(xiàn)SUMO1-/-小鼠MI后邊界區(qū)域Ankrd1的表達(dá)高于WT小鼠(圖3G)，提示SUMO1缺失增加了MI后CM-3簇的比例。此外，MI引發(fā)了CM-4簇比例的增加，但在SUMO1-/-小鼠中卻相反。CM-4簇主要表達(dá)干擾素相關(guān)基因，可能參與心臟的免疫監(jiān)測(cè)，而SUMO1缺失可能損害這種作用。
TF活性分析顯示，CM-3簇顯示出應(yīng)激相關(guān)TF的結(jié)合活性增加，如AP-1復(fù)合物中的Jun亞基(JunB和JunD)和Fos亞基(Fosl1和Fosl2)(圖3H)。JunD是CM肥大的負(fù)調(diào)控因子，在肥大刺激下降低ANP和BNP的表達(dá)。作者通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)MI后JunD與SUMO1的結(jié)合豐度。MI后，SUMO1的磷酸化水平和JunD的表達(dá)水平都降低了。與WT小鼠相比，SUMO1的缺失導(dǎo)致MI后JunD的表達(dá)進(jìn)一步降低(圖3I)。SUMO1與JunD結(jié)合的減少導(dǎo)致JunD穩(wěn)定性降低，從而增加了MI后Nppa/Nppb的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明，SUMO1主要通過(guò)調(diào)控邊界區(qū)CM-3簇參與心肌損傷。敲除SUMO1基因后，CM-3簇比例增加，心肌損傷相關(guān)基因表達(dá)水平增加，JunD參與了這一過(guò)程。
4.SUMO1基因的缺失抑制了MI后增生性FB簇向膠原分泌FB簇的轉(zhuǎn)化
為了探索FB亞群在MI后心臟重塑中的作用，作者將FBs細(xì)分為8個(gè)簇(FB1-8)，MI后，F(xiàn)B亞群大幅增殖 (圖4B)。作者使用CytoTrace分析FBs的分化軌跡，結(jié)果顯示，F(xiàn)B-2和FB-5簇(Postn、Col1a1和Col1a2低表達(dá))是初始狀態(tài)FBs亞群， FB-3和FB-6簇(Col1a1, Col1a2和Col3a1高表達(dá))是終末期FBs。與WT小鼠相比，MI后SUMO1-/-小鼠的FB-3和FB-6簇的比例有所降低。然而，F(xiàn)B-4簇的比例顯著增加，F(xiàn)B-4簇處于分化中間狀態(tài)，高表達(dá)增殖相關(guān)基因，表明其處于增殖狀態(tài)。使用Top2a和III型膠原進(jìn)行免疫熒光染色顯示，與WT小鼠相比，SUMO1缺失導(dǎo)致MI后梗死區(qū)FB大量增殖，但膠原分泌減少(圖4G)。I型和III型膠原免疫組化染色顯示，SUMO1缺失減少了MI后膠原分泌。作者發(fā)現(xiàn)SUMO1缺失引發(fā)梗死區(qū)部分破裂，提示修復(fù)能力不足(圖4H)。這些發(fā)現(xiàn)表明，多個(gè)FB亞群參與了MI后修復(fù)反應(yīng)，SUMO1缺失抑制了FBs從增殖狀態(tài)向膠原分泌狀態(tài)的分化。
5.SUMO1缺失促進(jìn)MI后具有血管再生能力的EC亞群增殖
心肌損傷后梗死部位新生血管網(wǎng)絡(luò)的重建和恢復(fù)對(duì)改善MI的預(yù)后至關(guān)重要。MI后的血管穩(wěn)態(tài)和新生血管是由ECs調(diào)節(jié)的。作者將ECs分為9個(gè)不同的EC亞群 (圖5A)。MI后EC-2、EC-5、EC-8和EC-9比例增加，而EC-1和EC-3比例相對(duì)Sham組減少，說(shuō)明MI后EC亞群參與不同功能(圖5B)。差異基因分析顯示，EC-2簇高表達(dá)冠狀動(dòng)脈EC標(biāo)記物Fabp4以及組織修復(fù)和血管生成標(biāo)記物Sparcl1，表明EC-2簇可能在心肌損傷的血管重建過(guò)程中充當(dāng)冠狀動(dòng)脈ECs。EC-5簇主要表達(dá)激活ECs亞群標(biāo)記物Selp和Rasa4。EC-7簇表達(dá)Sema3g，參與血管發(fā)育、血管生成和心肌缺血缺氧時(shí)新血管的重塑。利用Monocle擬時(shí)序分析EC亞群的發(fā)育軌跡，作者發(fā)現(xiàn)MI誘導(dǎo)EC分化，而SUMO1缺失進(jìn)一步促進(jìn)EC分化，因?yàn)镾UMO1-/-組聚集在終端狀態(tài)(圖5D和E)。具體來(lái)看，SUMO1缺失增加了MI后EC-2、EC-5、EC-7和EC-9簇的比例，這些亞群主要負(fù)責(zé)EC激活、冠狀動(dòng)脈/小動(dòng)脈血管重建和再生，有利于MI后的心功能恢復(fù)(圖5G)。
為了進(jìn)一步探討SUMO1缺失對(duì)MI后ECs的影響，作者用Pecam1和Ki67進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果顯示，SUMO1缺失促進(jìn)了Ki67+ ECs在MI后梗死區(qū)的分布。此外，Pecam1和α-SMA的免疫熒光結(jié)果顯示，SUMO1缺失導(dǎo)致梗死區(qū)大量小血管形成(圖5H)。這些結(jié)果表明，SUMO1缺失有利于EC增殖，從而促進(jìn)梗死區(qū)新生血管的形成。
6.SUMO1通過(guò)抑制VEGFA信號(hào)來(lái)阻止新生血管形成
為了進(jìn)一步研究心臟中不同細(xì)胞類(lèi)型之間的通信網(wǎng)絡(luò)，作者使用CellPhoneDB進(jìn)行了全面和系統(tǒng)的分析(圖6A)。EC2、EC-5和EC-9簇作為負(fù)責(zé)EC激活、冠狀動(dòng)脈/小動(dòng)脈血管生成和重建的EC亞群，受到CMs分泌的VEGFA的調(diào)控(圖6C)。為了研究SUMO1缺失是否促進(jìn)VEGFA介導(dǎo)的EC增殖，作者將SUMO1沉默(siSUMO1)和SUMO1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍靜脈EC(HUVECs)(圖6D和E)。在體外實(shí)驗(yàn)中，SUMO1的沉默顯著增強(qiáng)了VEGFA誘導(dǎo)的HUVECs的增殖和遷移能力(圖6F和G)。為了進(jìn)一步確定SUMO1是否介導(dǎo)VEGFA的血管生成信號(hào)，作者進(jìn)行了基質(zhì)管形成實(shí)驗(yàn)。在HUVECs中，SUMO1的沉默顯著促進(jìn)了VEGFA誘導(dǎo)的EC小管形成，而過(guò)表達(dá)SUMO1則導(dǎo)致了小管和分支數(shù)量的減少(圖6H和I)。此外，SUMO1基因沉默增加了VEGFA介導(dǎo)的HUVECs G2/M比例(圖6J和K)。這些發(fā)現(xiàn)表明，VEGFA促進(jìn)EC增殖的作用被SUMO1抑制，這不利于MI后的血管新生和血管重建。
7.CM特異性SUMO1基因治療減弱MI后的病理反應(yīng)
為了確定CM特異性SUMO1基因治療是否是一種有效的預(yù)防性治療策略，作者在8周齡小鼠尾靜脈注射腺相關(guān)病毒(AAV)，21天后進(jìn)行MI或假手術(shù)(圖7A)。與AAV-CTnT-EGFP對(duì)照組相比，AAV-CTnT-SUMO1轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠對(duì)MI誘導(dǎo)的異常心功能更有抵抗力，心功能障礙顯著減少，心肌損傷程度也較低(圖7B和C)。與對(duì)照組相比，CM特異性SUMO1過(guò)表達(dá)顯著降低MI后ANP和BNP mRNA水平(圖7E)。蘇木精、伊紅和Masson染色顯示，與對(duì)照組相比，AAV-CTnT-SUMO1轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠MI后梗死面積更小，心室重塑改善，纖維化水平顯著降低(圖7F和G)，且AAV-CTnT-SUMO1轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠的邊界區(qū)域CM面積顯著減小(圖7H)。免疫熒光結(jié)果顯示，AAV-CTnT-SUMO1轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠在梗死區(qū)周?chē)�表現(xiàn)出更少的Ankrd1+CMs和更高的JunD+CMs分布(圖7I)。這些結(jié)果表明，在病理?xiàng)l件下SUMO1在CMs中過(guò)表達(dá)可以緩解心臟重構(gòu)，增強(qiáng)心臟功能。  
結(jié)論
該研究確定了SUMO1在心肌損傷后心臟修復(fù)過(guò)程中的作用，并描述了SUMO1在MI后不同類(lèi)型的心臟細(xì)胞(包括CMs、FBs和ECs)中的功能。在高分辨率下確定了SUMO1的缺失觸發(fā)了不同類(lèi)型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜，并表明SUMO1通過(guò)不同的信號(hào)通路參與MI后的心臟重塑。該數(shù)據(jù)集也為進(jìn)一步研究SUMO1對(duì)MI后不同心臟細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用提供了寶貴的資源。  
參考文獻(xiàn)
Z. Liu, X. Liu, L. Liu, et al. SUMO1 regulates post-infarct cardiac repair based on cellular heterogeneity, Journal of Pharmaceutical Analysis, https://doi.org/10.1016/j.jpha.2022.11.010.