qPCR實(shí)驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng)和問題處理方法

首先，幫大家區(qū)分一下幾個(gè)生物實(shí)驗(yàn)中飄來飄去的“象形”詞——PCR、qPCR、逆轉(zhuǎn)錄/反轉(zhuǎn)錄……

PCR (Polymerase Chain Reaction)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則放大擴(kuò)增特定 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，即將微量的 DNA 指數(shù)增加。

qPCR (Quantitative Real-time PCR)：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，一般是 real-time PCR 的簡(jiǎn)稱。指在 PCR 反應(yīng)中，通過熒光化學(xué)物質(zhì)檢測(cè) PCR 循環(huán)后的產(chǎn)物總量，反應(yīng)中需通過內(nèi)參或外參對(duì)特定 DNA 進(jìn)行定量分析。后續(xù)可通過擴(kuò)增曲線 (Amplification curve) 和熔解曲線分析 (Dissociation curve) 定量結(jié)果。

逆轉(zhuǎn)錄或反轉(zhuǎn)錄 (Reverse transcription)：是指以 RNA 為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成 cDNA 的過程，通常所提及的 RT-PCR 或 RT-qPCR 詞中的 RT 便是此意。后續(xù)便可以此 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 或 qPCR 實(shí)驗(yàn)。

RNA-cDNA-qPCR，是做定量的一個(gè)常見實(shí)驗(yàn)流程，即先從目標(biāo)樣本中提取 RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到單鏈 cDNA，并以此為模板進(jìn)行 qPCR，大都為驗(yàn)證某個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量，那如何讓這個(gè)過程 “絲絲滑滑” 呢？

   
若想定量數(shù)據(jù)好，優(yōu)質(zhì) RNA 可是個(gè)寶！RNA 提取時(shí)的注意事項(xiàng)就不再 balabala 了，得到 RNA 后，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)分析那可少不了。嚯嚯，下面這兩方面可得好好 “宣講” 一下。
 
■ 濃度和純度
RNA 具有連續(xù)的吸光譜，其在 260 nm 處具有最高吸收峰；蛋白在 280 nm 處有最大吸收峰；230 nm 處的吸光度可反映乙醇、GTC、GuHCl、EDTA 等的含量。因此，在 RNA 的質(zhì)檢參數(shù)中，260、280 和 230 nm 下的吸光度分別代表了核酸、蛋白質(zhì)及有機(jī)溶劑等的值。一般情況下，RNA 純度檢測(cè)時(shí)我們大都只看其在 OD260/OD280 比例中的數(shù)值范圍，少量的蛋白、鹽或基因組等污染我們是可以接受的。

(得嘞，RNA，嬌貴嬌貴！包容包容！我懂我懂！)

■ 完整度評(píng)估

mRNA 約占總 RNA 的 3%，rRNA 約占總 RNA 的 80% 以上。一般可通過凝膠電泳對(duì) RNA (主要是 rRNA) 的完整性進(jìn)行評(píng)估。那如何通過 RNA 的膠圖分析這各種污染 “Bug” 呢？

以真核生物舉例：完整的總 RNA 電泳后會(huì)產(chǎn)生 28S、18S、5.8S 的 rRNA 條帶，28S 與 18S 的條帶強(qiáng)度大致比例應(yīng)為 2:1 (圖 3a)。電泳條帶 5.8S rRNA 出現(xiàn)則表示有輕微降解。RNA 本身就 “矯情”，得 “富養(yǎng)”~，因此在一般實(shí)驗(yàn)中，5.8S 條帶出現(xiàn)很正常，但如果只有這一種條帶且有明顯彌散現(xiàn)象 (圖 3b)，后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄的話還是建議 “及時(shí)止損” 吧！

 

若在 28S 以上出現(xiàn)多余的條帶，還賊亮，gDNA 污染，無疑了 (圖 3b)！若在點(diǎn)樣孔中還有明亮亮的 “釘子戶”，大概率的蛋白污染，可以“定罪了”。

真核生物膠圖的目的條帶為 23S、16S 和 5S，質(zhì)檢方法參照以上即可。

(如果你跑的膠明顯的干干凈凈、“不染世俗”，小可憐，RNA 提取，再來一遍吧！)

 

 

還是以真核生物舉例：RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，看似簡(jiǎn)單，實(shí)則 “心潮澎湃”，屢戰(zhàn)屢敗的實(shí)驗(yàn)汪們已經(jīng)小心到呼吸頻率都降低了，但各種問題還是奇奇怪怪，而且跨完 “此坑” 又見 “彼坑”。

冷靜冷靜，你能行！戳一戳，往期逆轉(zhuǎn)錄避坑指南，你想要的答案都在這里 (→RNA 逆轉(zhuǎn)錄失敗，達(dá)咩！)。
   
qPCR 到底有多“詭異”，你且看看這些痛苦科研汪的 “表白橋段”：
“實(shí)不相瞞，這 qPCR 的 S 曲線一點(diǎn)都不 S，它的腰去哪了？”——沒了！
“一杯敬實(shí)驗(yàn)，一杯敬文章，看完 qPCR 的結(jié)果，我不想談戀愛了。”——單著！
“看完我的 Ct 值，我就知道，不用 △△t 了，再愛已經(jīng)沒有意義了。”——分手！
“師姐，qPCR 都做好多次了，擴(kuò)增曲線還是亂七八糟，是不是我不配？”——不配！
 

圖 3. 標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線 (a) 和溶解曲線 (b)

 

天青色等煙雨，而我在等你，關(guān)于 qPCR 的一些 “紛紛擾擾”，你且聽我細(xì)細(xì)說。

 

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RT Master Mix for qPCR II (gDNA digester plus) 即用型預(yù)混液，一步操作即可完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，簡(jiǎn)便、快捷。試劑盒配有 gDNA digester 可去除 RNA 模板中的基因組 DNA 污染。

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SYBR Green qPCR Master Mix (High/ Low/No ROX) 是一種 2× 濃度的即用型預(yù)混液，含有 qPCR 的所有組分， 只需加入樣品 DNA，引物和水即可快速高效完成 qPCR 反應(yīng)。HY-K0521 (High ROX)，HY-K0522 (Low ROX)，HY-K0523 (No ROX)。

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