單細(xì)胞功能蛋白組學(xué)技術(shù)在腫瘤免疫治療研究中應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)

單細(xì)胞分泌（功能）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)揭示了同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子的少數(shù)高度多功能細(xì)胞亞群（subsets of highly-polyfunctional cells），這些超級(jí)細(xì)胞可以預(yù)測(cè)患者在體內(nèi)的反應(yīng)和疾病進(jìn)展，負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)和加速先進(jìn)治療藥物的開發(fā)。

 

目前最被關(guān)注的腫瘤免疫治療方法包括以PD-1/PD-L1抗體為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法、以CAR-T為代表的細(xì)胞免疫療法、腫瘤疫苗以及小分子抑制劑等新興免疫療法。近年來，大量以免疫單藥及聯(lián)合治療的臨床研究在國內(nèi)外陸續(xù)開展，取得了多項(xiàng)令人振奮的結(jié)果，腫瘤免疫治療生物標(biāo)記物在治療和預(yù)后預(yù)測(cè)中也展現(xiàn)出相當(dāng)?shù)臐摿?/span>。然而，免疫療法的作用機(jī)制比我們想象的更為復(fù)雜，受益群體相對(duì)有限，大多情況下只有少部分癌癥患者能夠從中獲益，PD-L1表達(dá)、腫瘤突變負(fù)荷（TMB）、高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）等生物標(biāo)志物無法完全滿足臨床需求，亟需探索更好的生物標(biāo)志物
 

單細(xì)胞分泌蛋白組學(xué)興起

免疫細(xì)胞在抗腫瘤、抗感染等免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞因子就像免疫細(xì)胞的“武器”，可以幫助免疫細(xì)胞有效對(duì)抗“敵人”，抵御和清除腫瘤及自身損傷細(xì)胞。不同細(xì)胞因子表現(xiàn)出廣泛的多效性，以協(xié)調(diào)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，通過分析免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可以幫助分析和評(píng)估細(xì)胞的免疫功能。有些免疫細(xì)胞不僅分泌一種細(xì)胞因子，可能分泌兩種、三種、四種或以上，可分泌兩種及以上細(xì)胞因子的細(xì)胞稱為“多功能細(xì)胞”（polyfunctional cells或multifunctional cells），在過去的十多年有很多研究發(fā)現(xiàn)，這群細(xì)胞比只分泌一種細(xì)胞因子的細(xì)胞（單功能細(xì)胞）的功能更強(qiáng)，在體內(nèi)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答更有效更持久。

 

傳統(tǒng)的細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)，如ELISA、流式微球分析（CBA，Cytometric Bead Array）、芯片多因子檢測(cè)等都是檢測(cè)血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清中群體細(xì)胞的平均蛋白信號(hào)，不能區(qū)分這些因子是由哪些細(xì)胞分泌的，也無法分辨單細(xì)胞分泌多種因子的多能性及共分泌的協(xié)同效應(yīng)，掩蓋了細(xì)胞分泌功能的異質(zhì)性。因此單個(gè)因子的檢測(cè)濃度高低，往往不能很好預(yù)測(cè)患者免疫治療的療效。

 

IsoPlexis單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開創(chuàng)性地實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平對(duì)直接發(fā)揮功能的活細(xì)胞分泌蛋白組進(jìn)行全自動(dòng)檢測(cè)，通過微流控芯片捕獲單細(xì)胞、進(jìn)行活細(xì)胞培養(yǎng)、逐一檢測(cè)每個(gè)單細(xì)胞分泌的多達(dá)32種細(xì)胞因子，通過生信軟件自動(dòng)數(shù)據(jù)分析和可視化。對(duì)比分析免疫細(xì)胞亞群的細(xì)胞因子分泌差異，將不同細(xì)胞因子種類和信號(hào)強(qiáng)度關(guān)聯(lián)到相應(yīng)細(xì)胞功能，研究免疫細(xì)胞亞群功能異質(zhì)性和多功能性，找到在免疫應(yīng)答反應(yīng)中具有超強(qiáng)作戰(zhàn)能力的“超級(jí)英雄細(xì)胞”，并生成獨(dú)特的“細(xì)胞多功能指數(shù)（PSI）”，更全面地分析免疫細(xì)胞的綜合功能。單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，成為免疫治療研究中生物標(biāo)志物探索的有利新工具。

IsoCode 單細(xì)胞適應(yīng)性免疫應(yīng)答panel

 

單細(xì)胞分泌蛋白組學(xué)提供的數(shù)據(jù)

以德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心Adi Diab等發(fā)表在Journal of Clinical Oncology的文章為例：在BEMPEG（改造的偏向性IL-2受體激動(dòng)劑）+ Nivo（PD-1單抗）聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤II期臨床研究中，研究者在用藥前后不同周期采集患者外周血PBMC，通過IsoPlexis單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)CD4+T、CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌譜，包括發(fā)揮免疫效應(yīng)功能、免疫刺激作用、趨化作用、免疫調(diào)節(jié)、炎癥相關(guān)功能的五大職能32種細(xì)胞因子的檢測(cè)分析。回顧性分析與患者預(yù)后和療效相關(guān)的生物標(biāo)志物，包括：

●應(yīng)答組和非應(yīng)答組受試者治療前（C1D1）、治療后（C1D8）外周血CD8+T細(xì)胞分泌因子差異分析；

●治療一周后，應(yīng)答組細(xì)胞因子分泌多樣性更高，多因子組合的分泌頻率更高（橫向條塊顏色越深，比例越高），主要由具有效應(yīng)功能的細(xì)胞因子所驅(qū)動(dòng)，其他趨化性、刺激性和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子也有不同程度的貢獻(xiàn)；

CD8+T細(xì)胞分泌因子譜多功能熱圖

 

●根據(jù)細(xì)胞因子分泌差異，分析應(yīng)答組和非應(yīng)答組受試者治療前（C1D1）、治療后（C1D8）外周血CD8+T細(xì)胞多功能性（可分泌多種因子的細(xì)胞占比）；

●治療一周后，應(yīng)答組多功能性CD8+T細(xì)胞增多；

CD8+T多功能細(xì)胞比例

 

●分析應(yīng)答組和非應(yīng)答組受試者治療前（C1D1）、治療后（C1D8）外周血CD8+T細(xì)胞多功能指數(shù)（結(jié)合多功能細(xì)胞比例及其分泌的各種因子的信號(hào)強(qiáng)度）；

●治療緩解組（CR+PR）患者的CD8+ T細(xì)胞的PSI升高約2.2倍，具有顯著差異（P＜0.01）；

CD8+T單細(xì)胞多功能指數(shù)（PSI）

 

細(xì)胞多功能指數(shù)（PSI），是結(jié)合多功能細(xì)胞比例及其分泌的各種因子的信號(hào)強(qiáng)度的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

 

 

●治療后與基線樣本配對(duì)分析，外周血免疫細(xì)胞PSI中值變化倍數(shù)（PSD）；

●CD8+T細(xì)胞PSD與客觀緩解率（ORR）顯著相關(guān)，可成為與患者應(yīng)答呈正相關(guān)的預(yù)測(cè)性血液生物標(biāo)志物；

 

●長期隨訪，分析PSD（ PSI中值變化倍數(shù)）與患者無進(jìn)展生存期（PFS）的關(guān)系；

在為期3年的研究過程中，CD8+T細(xì)胞PSD高的患者表現(xiàn)出更好的遠(yuǎn)期預(yù)后效果，或治療結(jié)果改善。

本研究證明了BEMPEG + Nivo聯(lián)合免疫療法治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的有效性和安全性，IsoPlexis的細(xì)胞多功能指數(shù)（PSI）及其變化倍數(shù)（PSD）是有效預(yù)測(cè)患者總體緩解率的關(guān)鍵指標(biāo)。

IsoPlexis平臺(tái)分析的預(yù)測(cè)性血液生物標(biāo)志物，使研究人員能夠比以前的傳統(tǒng)技術(shù)更早地評(píng)估患者對(duì)Nivo/Bempeg治療的反應(yīng)。加速對(duì)難治性癌癥的洞察，如轉(zhuǎn)移性黑素瘤，鑒別與患者持久反應(yīng)相關(guān)的治療。
 

IsoPlexis單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，正在被越來越多的研究者選擇，在腫瘤免疫療法開發(fā)和臨床研究中，幫助研究者進(jìn)行相關(guān)生物標(biāo)記物的檢測(cè)分析，揭示患者臨床獲益或耐藥相關(guān)的機(jī)制，以更好地實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療從而選擇最為適合的治療方案。

 

IsoPlexis在腫瘤免疫臨床

和臨床前研究中的代表文獻(xiàn)