人臍帶間充質干細胞分離培養(yǎng)方法及注意事項

上一篇文章帶著大家了解了干細胞的起源，從受精卵到桑葚胚(modula)再到囊胚階段，以及干細胞的特性和分類，還有骨髓間充質干細胞的分離提取方法。

那大家知道最容易獲取的間充質干細胞組織是什么嗎？——沒錯，它就是臍帶。今天帶大家一文了解臍帶間充質干細胞的來源、優(yōu)勢以及分離培養(yǎng)等知識要點。

臍帶間充質干細胞來源于臍帶組織中的一種基質膠，名為華通氏膠！英國的物理學家和解剖學家托馬斯·華通氏（Thomas Wharton 1614-1673）于1656年最先在其書內描述了該組織，故取他的名字命名。臍帶的解剖結構為2條臍動脈、1條臍靜脈和全程包裹著3條臍帶血管的華通氏膠，華通氏膠的重要作用之一是能夠保護臍帶血管不受外力的機械性壓迫或扭曲。華通氏膠外觀呈乳白色半透明狀，主要成分為透明質酸（hyaluronic acid）和硫酸軟骨素（chondroitin sulfate）。

因其中含有豐富的間充質干細胞，根據(jù)其來源的組織將這種間充質干細胞即命名為臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cell, UCMSC）。
 

臍帶三維結構
（Stem Cells Translational Medicine 2017;6:1620–1630）

UCMSC/GFP鏡下圖

據(jù)悉，2022年國內共有17個干細胞類新藥獲得國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（CDE）臨床試驗默示許可IND，主要用于乙肝病毒肝硬化、冠心病、強直性脊柱炎、燒傷、狼瘡腎炎、關節(jié)炎等治療研究。細胞來源以人骨髓、脂肪、臍帶組織的MSC為主，其中人臍帶間充質干細胞相關研究占據(jù)半壁江山，可見潛力無限。
 

材料準備
1.樣本：采集8小時內的臍帶一條，長度≥5cm，保存溫度4℃。
2.試劑：OriCell^®人臍帶間充質干細胞完全培養(yǎng)基50mL，OriCell^®PBS 100mL。
3.耗材：50mL無菌采集瓶一個，50mL離心管5-10個，10mL移液管4個，T75培養(yǎng)瓶若干個。

臍帶處理
1.1 無菌打開臍帶采集瓶，倒掉保存液。
1.2 用OriCell^®PBS清洗臍帶采集瓶中的臍帶，兩遍。
1.3 用鑷子取出臍帶，用OriCell^®PBS洗凈臍帶外周血漬。
1.4 剪掉綁有臍帶綁繩的兩端，中間段臍帶使用有齒鑷和止血鉗去除臍靜脈和臍動脈內的殘留血液，再次清洗一次，并將臍帶剪成3cm左右長的小段。
1.5 去除臍帶的1條臍靜脈和2條臍動脈，分離出華通氏膠。

注意：
一定要將1條臍靜脈和2條臍動脈剔除干凈，撕出的華通氏膠盡量不要帶有靜動脈和羊膜組織，否則容易引入雜細胞，影響UCMSC的后續(xù)純度。

靜動脈內部和臍帶表面殘留的血液需要洗干凈，同樣目的是避免混入過多紅細胞在初期吸收過多培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質，影響后續(xù)UCMSC的生長和增殖。

1.6 用彎剪將離心管中華通氏膠剪成2-3mm²大小。
1.7 將華通氏膠轉移至50mL離心管中，用電子天平稱取1g組織塊。
1.8 在組織塊中加入10mL OriCell^®人臍帶間充質干細胞完全培養(yǎng)基，混勻。
1.9 將其轉移到T75培養(yǎng)瓶中，并將組織塊均勻鋪在T75培養(yǎng)瓶內。
2.0 將培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中。

換液及傳代培養(yǎng)
換液操作
3.1 完成臍帶原代處理后第5天，進行第一次換液。
3.2 盡量在不影響組織塊貼壁的情況下，回收培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)液和未貼壁的組織塊。
3.3 回收組織塊和舊的培養(yǎng)基經(jīng)過250×g，6min離心后，倒掉上清液。
3.4 重新加入10mL OriCell^®人臍帶間充質干細胞完全培養(yǎng)基，重新接種于T75培養(yǎng)瓶。

注意：全程都要動作輕柔，盡量不影響貼壁組織塊的貼壁。
3.5 完成第一次換液后第7天，細胞第二次半換液(可以根據(jù)生長情況適當調整)。
3.6 盡量在不影響組織塊貼壁的情況下，用10mL移液管回收培養(yǎng)瓶內的半量培養(yǎng)液。
3.7 重新加入5mL OriCell^®人臍帶間充質干細胞完全培養(yǎng)基于T75培養(yǎng)瓶中。
3.8 完成第二次換液后每隔3天進行半換液一次，直到細胞可以進行傳代。

P0→P1的傳代培養(yǎng)操作
4.1 確認可以進行細胞傳代后，去除漂浮和大塊的組織塊。合并回收培養(yǎng)瓶內的組織塊和細胞培養(yǎng)液。
4.2 經(jīng)600×g，離心5min，收集上清液。
4.3 培養(yǎng)瓶內的細胞使用OriCell^®PBS涮洗殘留的培養(yǎng)基后，T75培養(yǎng)瓶加入3mL OriCell^®0.25%胰蛋白酶，消化貼壁細胞。
4.4 消化完成后按T75培養(yǎng)瓶加入之前收集的上清液5mL終止消化，剩余組織塊混合液留離心管中，標記，存4℃冰箱備份，直至細胞完成凍存。
4.5 回收所有細胞懸液加入OriCell^®PBS至45mL后經(jīng)100μm細胞濾網(wǎng)過濾收集濾液，250×g，6min離心后棄去上清。
4.6 細胞沉淀用30mL OriCell^®PBS重懸，取樣300ul左右細胞懸液，計數(shù)細胞數(shù)量和活率。
4.7 根據(jù)接種密度要求，吸取需要的細胞懸液，250×g，6min離心后棄去上清，加入25mL OriCell^®人臍帶間充質干細胞完全培養(yǎng)基接種于1個T175培養(yǎng)瓶內。
4.8 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中37℃，5%CO₂條件培養(yǎng)。

P1后傳代的操作
5.1 將完全培養(yǎng)基、PBS、胰酶預熱至37℃。
5.2 吸去培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基。用PBS(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)洗滌細胞2次，注意動作輕柔，清洗全面，吸去PBS。
5.3 加入胰酶(T25培養(yǎng)瓶加入約1.5mL，T75培養(yǎng)瓶加入約3mL)，迅速鋪勻，保證充分接觸細胞表面。
5.4 顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細胞收縮變圓后，輕拍培養(yǎng)容器外壁，使細胞脫離培養(yǎng)表面。立即加入完全培養(yǎng)基(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)，隨即輕搖培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻，終止消化。
5.5 使用吸管或移液管吸取細胞懸液，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細胞都吹打下來。

注意：吹打動作不可劇烈，避免產生大量氣泡，否則可能損傷和損失細胞。
5.6 將細胞懸液轉移至離心管中。用PBS(T25培養(yǎng)瓶加入約3mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6mL)洗滌容器1次，收集殘留細胞。
5.7 收集的所有細胞懸液以250×g，離心4min。
5.8 離心后去除上清。加入2mL完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散、混勻。將細胞按(2.5~4)×10⁴個活細胞/cm²接種至適宜的培養(yǎng)容器內。

注意:
培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞對于細胞密度有較高的要求，我們建議有條件且計數(shù)效率較高的情況下，進行手工計數(shù)，以期獲得精準的細胞濃度指導接種；在沒有精確計數(shù)條件的情況下，按照適宜比例傳代是更好的方法。

通常人臍帶間充質干細胞傳代比例為1:3，72h內生長至可傳代匯合度。請根據(jù)細胞實際生長情況調整傳代比例。

5.9 搖勻細胞，放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養(yǎng)箱中。
5.10 傳代次日，觀察細胞狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)較多漂浮細胞，應予以換液。待細胞生長至90%匯合，即需傳代或凍存。

注意：正常情況下人臍帶間充質干細胞每代生長時間不超過72h，中途不需要換液。頻繁換液會破壞構建起的細胞微環(huán)境

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