分子克隆技術(shù)的原理和一般實(shí)驗(yàn)流程

70年代初期基因工程分子克隆技術(shù)的誕生將生命科學(xué)研究推入了一個(gè)快速發(fā)展的新時(shí)代，以它作為研究的切入點(diǎn)許多的生物學(xué)難題取得了突破性解決�；�因可以在物種之間轉(zhuǎn)移表達(dá)，基因工程藥物得到開發(fā)，基因治療得以實(shí)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植物、動(dòng)物等農(nóng)業(yè)新品種被培育出來，生物進(jìn)化從此進(jìn)入了人類知識(shí)干預(yù)的歷史進(jìn)程。被評(píng)為世紀(jì)三大科學(xué)成就之一的“人類基因組測序”的實(shí)現(xiàn)，也是在分子克隆技術(shù)基礎(chǔ)上的人類一大杰作。生命科學(xué)的內(nèi)容不再是條塊分割的拼盤，而是以分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的概念為一體的、統(tǒng)一的生物學(xué)。
 

圖1 基因編輯（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

What？分子克隆的概念

分子克隆（基因克隆/DNA重組/載體構(gòu)建）技術(shù)在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再從篩選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增。其主要目的就是大量擴(kuò)增目的基因，為下一步的基因功能研究做準(zhǔn)備。可以應(yīng)用于蛋白表達(dá)、病毒包裝、基因治療、細(xì)胞治療、mRNA疫苗、RNAi干擾、細(xì)胞功能等研究。
 

圖2 分子克隆技術(shù)

分子克隆技術(shù)簡單地可以理解為將DNA片段(或基因)與載體共價(jià)連接，然后引入寄主細(xì)胞，再篩選獲得重組的克隆。分子克隆方法的第一步是獲得所需的插入物（目的基因），目的基因可以是來自真核、原核生物的任何細(xì)胞類型的DNA或mRNA，也可以是實(shí)驗(yàn)室直接合成的。通過PCR、酶切等技術(shù)將基因組DNA或cDNA（通過mRNA體外逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA）中分離得到一段含有目的基因的DNA序列，通過產(chǎn)物純化后連接到線性化的載體上。關(guān)于載體一般常用到的是質(zhì)粒載體，它是一種小型環(huán)狀DNA分子—在基因工程中作為最常用，最簡單的載體。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。通過用相同的限制性內(nèi)切酶(例如EcoRI等)切割載體DNA和外源DNA（目的基因），使切割后載體與外源DNA產(chǎn)生末端相容的構(gòu)型。將載體和制備的目的DNA混合在DNA連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，從而完成了重組DNA的構(gòu)建。
 

完成目的基因與載體的重組后還不完事哦！要將重組DNA導(dǎo)入宿主生物體（一般選擇的是大腸桿菌）進(jìn)行大量復(fù)制。作為宿主的工程菌在某些化學(xué)條件或物理刺激下會(huì)改變其細(xì)胞膜的通透性,從而易于將細(xì)胞表面附著的外源基因吸收到胞內(nèi),這一過程即轉(zhuǎn)化。利用選擇標(biāo)記可以很容易鑒別成功導(dǎo)入目的基因的工程菌,比如抗生素抗性篩選——凡是成功導(dǎo)入重組載體的工程菌均獲得某種抗生素抗性,而未導(dǎo)入的工程菌則不能在含該抗生素的培養(yǎng)基中生長，這就是初步陽性菌株的篩選。后續(xù)進(jìn)行相應(yīng)的陽性單克隆鑒定以及質(zhì)粒測序即圓滿完成分子克隆實(shí)驗(yàn)。
 

圖3 質(zhì)粒圖譜

整個(gè)分子克隆從設(shè)計(jì)引物開始,根據(jù)需要拿到的目的蛋白相應(yīng)地核酸序列,設(shè)計(jì)出含有酶切位點(diǎn)及所需Tag的特異性引物分子。剩下就是獲得目的基因、酶切、連接、轉(zhuǎn)化和篩選、菌液PCR或酶切鑒定及測序比對(duì)。主要的實(shí)驗(yàn)流程如下圖所示，不同的克隆方法（我們下期繼續(xù)介紹）在酶切和連接的步驟會(huì)有所不同，不同整體的流程基本一致。
 

圖4 分子克隆技術(shù)一般流程圖