標記定量蛋白質(zhì)組學應用于水稻廣譜抗性、穩(wěn)產(chǎn)新基因研究

水稻是全球最重要的糧食作物之一，但其長期受到了許多病原真菌、細菌、卵菌、線蟲和病毒的威脅，因此降低了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。培育對一種病原體的大多數(shù)株系/種或一種以上病原體具有抗性的優(yōu)良品種是最經(jīng)濟和最環(huán)保的病害防控措施，因此迫切需要發(fā)掘廣譜抗性(BSR)基因。

2023年1月，四川農(nóng)業(yè)大學王文明教授團隊在植物學頂刊Nature Plants（N1級中科院大類TOP，IF=17.352）在線發(fā)表了題為“A natural allele of proteasome maturation factor improves rice resistance to multiple pathogens”的研究論文，該研究通過轉(zhuǎn)錄組學篩選到了具有廣譜抗性的基因UMP1^R2115，并通過標記定量蛋白組學進行了機制解析，證實了UMP1^R2115對多種病原菌的抗性，且不影響水稻產(chǎn)量。中科新生命為該研究提供了標記定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)服務(wù)。

 

 研究材料

雅恢2115水稻、TP309水稻、轉(zhuǎn)入和敲除UMP1^R2115的TP309水稻

 

 技術(shù)路線

步驟1：轉(zhuǎn)錄組學篩選廣譜抗性基因；

步驟2：UMP1^R2115基因廣譜抗性的確認；

步驟3：蛋白組學解析UMP1^R2115對稻瘟病的抗性機制；

步驟4：UMP1^R2115抗稻瘟病機制驗證；

步驟5：UMP1^R2115對多種病原菌具有抗性且不影響水稻產(chǎn)量。

 

 研究結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)錄組學篩選廣譜抗性基因

雅恢2115(R2115)是四川農(nóng)業(yè)大學培育的一個優(yōu)質(zhì)多抗超級稻恢復系，它對水稻稻瘟病表現(xiàn)出廣譜抗性。作者使用該品系水稻探索其BSR基因。本研究中，作者對稻瘟菌侵染的R2115、易感水稻麗江新團黑谷(LTH)和3個小種特異抗稻瘟病單基因系進行了轉(zhuǎn)錄組分析（圖1a）。16924個顯著差異基因（DEG）被分為10個亞簇，其中亞簇3中的DEG僅在R2115中高表達(圖1b)。KEGG通路分析結(jié)果顯示亞簇3中的DEG在蛋白酶體和程序性細胞死亡中富集(圖1c)。進一步分析富集通路中的基因發(fā)現(xiàn)編碼蛋白酶體成熟因子OsUMP1的Os03g0583700（OsUMP1基因）在R2115中高表達(圖1d)。

 

2. UMP1^R2115基因廣譜抗性的確認

為了驗證R2115中OsUMP1基因（UMP1^R2115）的廣譜抗性，作者首先構(gòu)建了OsUMP1的突變株。發(fā)現(xiàn)敲除OsUMP1基因的水稻（DZ108、TP309）均表現(xiàn)出病變區(qū)域的增大和稻瘟菌感染的增多（圖1e-1h）。隨后，作者將R2115的OsUMP1等位基因轉(zhuǎn)入至TP309水稻（UMP1^R2115水稻）中，病變區(qū)域和稻瘟菌生長量均減少（圖1i-1j）。此外，作者用稻瘟菌感染TP309、UMP1^R2115水稻和UMP1敲除的水稻，發(fā)現(xiàn)稻瘟菌在轉(zhuǎn)入UMP1^R2115基因的水稻中增長受限（圖1k-1l）。綜上所述，UMP1^R2115對稻瘟菌具有侵入前和侵入后的抗性。

 

3. 蛋白組學解析UMP1^R2115對稻瘟病的抗性機制

已知UMP1基因同源物在擬南芥和釀酒酵母中參與蛋白酶體的形成，研究發(fā)現(xiàn)水稻中的UMP1也發(fā)揮了蛋白酶體形成的功能，實驗分析中UMP1^R2115水稻與TP309相比，表現(xiàn)出更高水平的蛋白酶體豐度和活性（圖2a-2e）。

隨后作者采用iTRAQ標記定量蛋白質(zhì)組學的方式檢測UMP1^R2115水稻和TP309之間的蛋白質(zhì)水平的變化（圖2f），研究發(fā)現(xiàn)在鑒定到的2767個蛋白中，UMP1^R2115中三種抗血酸過氧化物酶B8AU10(POD)、A3A7Y3 (OsAPX8)、B9FV80(POD)和CAT A0A0R7FMX6 (OsCatB)蛋白水平均有所降低（圖2g）。 ELISA實驗進一步證實了UMP1^R2115水稻中的參與抑制植物免疫和負調(diào)控水稻抗病性的POD和CAT蛋白表達水平的降低，活性也降低（圖2h-2k）。而H₂O₂水平增加（圖2l）。這表明了UMP1^R2115中蛋白酶體-POD/CAT-H₂O₂的潛在防御途徑。
 

 

4. UMP1^R2115抗稻瘟病機制驗證

作者首先驗證UMP1^R2115介導的防御是否需要有活性的蛋白酶體。在稻瘟菌感染前加入了蛋白酶體抑制劑MG132，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加了MG132的UMP1^R2115水稻病變區(qū)域增大、且稻瘟菌感染更多（圖3a-3c）。因此，UMP1^R2115介導的稻瘟病抗性需要活躍的26S蛋白酶體，POD和CAT蛋白的降解明顯依賴于蛋白酶體。

然后驗證POD和CAT在UMP1^R2115稻瘟菌抗性中的作用，作者將POD/CAT編碼基因在水稻中過表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其破壞了UMP1^R2115介導的稻瘟菌抗性（圖3d-3i）。
 

 

5. UMP1^R2115對多種病原菌具有抗性且不影響水稻產(chǎn)量

接下來為了研究蛋白酶體-POD/CAT-H₂O₂防御通路是否由病原體信號誘導的，作者用幾丁質(zhì)或flg22處理TP309和UMP1^R2115水稻。研究發(fā)現(xiàn)在UMP1^R2115水稻中，蛋白酶體水平增強、POD和CAT量減少，H₂O₂量更高，證實了UMP1^R2115介導的防御是幾丁質(zhì)和flg22誘導的（圖4a-4e）。

由于幾丁質(zhì)和flg22分別是真菌和細菌的主要激發(fā)子，作者研究了UMP1^R2115對多種細菌和真菌病原體的抗性（圖4f-4k）,結(jié)果證實UMP1^R2115增強了對具有獨特生活方式的病原體亦具有抗性。

此外作者還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入UMP1^R2115基因的TP309水稻和正常的TP309水稻，在植物形態(tài)、產(chǎn)量上均相當，即UMP1^R2115的轉(zhuǎn)入既具有病菌的廣譜抗性亦不影響水稻產(chǎn)量（圖4l-4s）。

小編小結(jié)

該研究在雅恢2115中篩選到了一個編碼蛋白酶體成熟因子的天然等位基因UMP1^R2115，該基因?qū)Χ喾N病害具有廣譜抗性對水稻產(chǎn)量沒有影響。此外通過蛋白組學的機制解析發(fā)現(xiàn)了UMP1^R2115具有廣譜抗性的通路，即活性26S蛋白酶體-POD和CAT降解-H₂O₂提高，從而增強水稻對多種病原菌的抵御能力。UMP1^R2115的發(fā)現(xiàn)為培育抗多種病害的高產(chǎn)水稻品種提供了新的基因資源。