文獻(xiàn)解析：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序解析結(jié)腸癌骨髓靶向治療的機(jī)制

免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）治療的應(yīng)用，在多種腫瘤治療中取得良好療效，極大的改變了腫瘤治療策略。然而在臨床試驗(yàn)中，依然有部分患者無法從中獲益，例如基因組微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）的結(jié)直腸癌（CRC）病人。除了靶向T細(xì)胞的免疫治療外，靶向髓系免疫細(xì)胞，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）和樹突狀細(xì)胞（DC）的多項(xiàng)治療策略也已進(jìn)入臨床前試驗(yàn)階段。
 
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）是確定腫瘤中細(xì)胞多樣性的有力工具，但其在解析免疫治療機(jī)制方面的應(yīng)用卻很少。腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性導(dǎo)致的生物學(xué)功能、不同髓系細(xì)胞亞群之間的關(guān)系以及靶向髓系細(xì)胞的免疫治療的不同應(yīng)答都尚不清楚。
 
一篇題為“Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer”的研究于2020年發(fā)表在Cell上，研究利用scRNA-seq繪制了結(jié)腸癌患者的腫瘤、鄰近正常組織以及血液中的免疫細(xì)胞高分辨率圖譜，構(gòu)建了細(xì)胞之間的互作網(wǎng)絡(luò)以確定參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展以及抗腫瘤免疫性的關(guān)鍵細(xì)胞群體，并探討了目前正在進(jìn)行臨床測試的骨髓靶向免疫療法的潛在機(jī)制。
 
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
研究者結(jié)合液滴法（10x Genomics）及平板法（SMART-seq2）兩種scRNA-seq技術(shù)，對(duì)18例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織、癌旁正常組織及外周血中的CD45+免疫細(xì)胞及CD45-基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，刻畫了高分辨率的結(jié)直腸癌免疫圖譜。  
 
 
單細(xì)胞測序技術(shù)的主要應(yīng)用結(jié)果
1. 鑒定人類CRC的瘤內(nèi)細(xì)胞類型
研究者采用兩種單細(xì)胞測序技術(shù)，對(duì)18例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織、癌旁正常組織及外周血進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得了43,817個(gè)（10x scRNA-seq）和10,468個(gè)（Smart-seq2）單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本。比較兩種技術(shù)，前者細(xì)胞數(shù)量大，可有效的獲得更多細(xì)胞亞群；而后者能夠捕獲更多的基因，可深入分析調(diào)控信號(hào)通路。根據(jù)這些轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，研究人員刻畫了高分辨率的結(jié)直腸癌免疫圖譜（圖2），包括13個(gè)髓系細(xì)胞亞群、4個(gè)ILC細(xì)胞亞群、18個(gè)T細(xì)胞亞群和5個(gè)B細(xì)胞亞群。  
 
2. CRC浸潤髓系細(xì)胞亞群的組織特異性模式
研究人員對(duì)13種髓系細(xì)胞亞群的基因特征進(jìn)行分析，將其注釋為以下亞群（圖3A-C）：一個(gè)肥大細(xì)胞亞群（hM01）；三個(gè)樹突狀細(xì)胞（DC）亞群（hM02-hM04），包括漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC）、cDC2和cDC1細(xì)胞；三個(gè)血液中富集的單核細(xì)胞亞群（hM05-hM07）；其他亞群被鑒定為巨噬細(xì)胞，分為組織駐留巨噬細(xì)胞（RTMs）（hM08-hM10）和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）（hM12-hM13）。
 
在所有RTM亞群中，均觀察到促炎細(xì)胞因子基因IL1B的表達(dá)，其中hM08亞群中的表達(dá)量最高，hM09特異性表達(dá)LYVE1和IL10，可能在抑制炎癥和纖維化方面起到重要作用（圖3D）。進(jìn)一步，通過RNA速率分析，研究人員發(fā)現(xiàn)從表達(dá)CD14的單核細(xì)胞向FCN1+單核類似細(xì)胞（hM11）和不同巨噬細(xì)胞亞群之間具有明顯的定向流動(dòng)，提示了巨噬細(xì)胞的發(fā)育軌跡（圖3E-F）。  
 
3. CRC中TAMs的功能及細(xì)胞互作
根據(jù)以上的細(xì)胞聚類和巨噬細(xì)胞的發(fā)育軌跡分析，研究人員將TAMs分為具有不同發(fā)育軌跡和不同功能的C1QC+ TAM（hM12）和SPP1+ TAM（hM13）兩個(gè)細(xì)胞亞群。前者可能通過hM10發(fā)育而來，具有細(xì)胞吞噬和抗原呈遞的功能，后者可能由hM08發(fā)育而來，具有促血管生成及促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的功能（圖4A-D）。
 
基于scRNA-seq和TCGA數(shù)據(jù)，預(yù)測構(gòu)建了CRC腫瘤中的細(xì)胞亞群互作網(wǎng)絡(luò)，TAMs和cDC作為互作網(wǎng)絡(luò)的核心，與其他細(xì)胞亞群的關(guān)聯(lián)最多。其中SPP1+ TAM主要與腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞（CAFs）和成纖維細(xì)胞發(fā)生相互作用；而C1QC+ TAM主要與兩種cDC和多種T細(xì)胞亞群細(xì)胞互作，在調(diào)節(jié)抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答中起作用（圖4E）。進(jìn)一步，配體-受體互作得分分析也確認(rèn)了C1QC+ TAM在招募或激活T細(xì)胞中具有潛在作用，SPP1+ TAM與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)（圖4F）。
 
隨后，研究人員整合了腫瘤相關(guān)的小鼠髓系細(xì)胞亞群與人類的髓系細(xì)胞亞群，確定了15個(gè)離散細(xì)胞簇，并發(fā)現(xiàn)在人類結(jié)直腸癌患者和小鼠腫瘤模型之間存在功能相似的TAM細(xì)胞亞群（圖G-H）。  
 
4. 促進(jìn)血管生成的巨噬細(xì)胞亞群對(duì)anti-CSF1R治療具有耐受性
接下來，研究人員利用小鼠腫瘤模型來研究靶向不同髓系細(xì)胞的免疫治療對(duì)抗腫瘤免疫反應(yīng)造成的影響。在小鼠模型中進(jìn)行anti-CSF1R治療后，分析了小鼠腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。相較于對(duì)照抗體治療，anti-CSF1R治療的小鼠減少了TAMs的頻率，C1QC+ TAM特征的巨噬細(xì)胞亞群（mM12和mM14）幾乎完全消失，而SPP1+ TAM特征的巨噬細(xì)胞減少很少（mM11、mM13和mM15）（圖5A-D）。Anti-CSF1R治療可以影響處在細(xì)胞周期中的巨噬細(xì)胞的增殖，不同巨噬細(xì)胞亞群對(duì)anti-CSF1R治療的敏感性不同（圖5F-H）。
 
為挖掘以上結(jié)果與人類的關(guān)聯(lián)性，研究人員比較了人類結(jié)直腸癌患者的生存率，發(fā)現(xiàn)低C1QC+ TAM和高SPP1+ TAM的組合與較差的預(yù)后相關(guān)（圖5I）。綜上所述，anti-CSF1R治療可能不足以耗盡所有具有促進(jìn)腫瘤生長潛力的巨噬細(xì)胞亞群，這可能是其在小鼠腫瘤模型和人類癌癥患者中單藥治療效果不佳的原因。  
 
5. Anti-CD40治療導(dǎo)致cDC1群體的早期特異性擴(kuò)增
 
研究人員對(duì)小鼠模型進(jìn)行了anti-CD40治療，觀察到小鼠腫瘤生長的減少，這一現(xiàn)象在結(jié)合PD1阻斷治療時(shí)得到了進(jìn)一步的增強(qiáng)（圖6A-B）。在包括cDC1在內(nèi)的多個(gè)髓系細(xì)胞和T細(xì)胞亞群中存在CD40的表達(dá)，且cDC與多種T細(xì)胞亞群之間存在廣泛互作（圖6C-E）。治療后不同時(shí)間點(diǎn)的scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析顯示，anti-CD40治療早期激活的主要髓系細(xì)胞是Ccl22+ cDC1細(xì)胞，這些被激活的Ccl22+ cDC1細(xì)胞表達(dá)CD80、CD86以及IL-12，活化cDC1s的標(biāo)記基因與CRC患者的良好預(yù)后存活率呈正相關(guān)，提示anti-CD40治療激活的這些細(xì)胞功能可能與人類癌癥有關(guān)（圖6F-J）。  
 
6. Anti-CD40治療增加效應(yīng)記憶CD8+ T細(xì)胞并誘導(dǎo)腫瘤中Bhlhe40+ Th1類似細(xì)胞的活化和擴(kuò)增
 
為探索anti-CD40治療影響腫瘤浸潤性T細(xì)胞功能的具體機(jī)制，研究人員對(duì)治療后小鼠模型中的T細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)Anti-CD40治療顯著增加了腫瘤記憶CD8+ T細(xì)胞亞群的比例，并降低了耗盡CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量（圖7）。
 
同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)anti-CD40治療對(duì)腫瘤浸潤的CD4+ T細(xì)胞亞群也有顯著影響，在治療的第2天促進(jìn)了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell; Treg）的擴(kuò)張，但在第10天抑制了Treg的擴(kuò)張；而在anti-CD40治療后的第2天和第10天都特異性地誘導(dǎo)了Bhlhe40+ Th1類似細(xì)胞的克隆增殖，以及Bhlhe40+ Th1類似細(xì)胞中Cd40lg的表達(dá)，增強(qiáng)了其與cDC1細(xì)胞之間的相互作用（圖8）。  
   
主要結(jié)論
1. scRNA-seq的數(shù)據(jù)提示TAMs和cDCs包含細(xì)胞與細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心，TAMs通過與CRC免疫微環(huán)境中不同的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞相互作用發(fā)揮兩種不同的功能。
 
2. 兩種不同的TAMs亞群分別具有細(xì)胞吞噬、抗原呈遞以及促血管生成、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的功能。
 
3. Anti-CSF1R治療會(huì)特異性消除具有炎癥特性的巨噬細(xì)胞，但對(duì)表達(dá)促進(jìn)血管生成、腫瘤發(fā)展相關(guān)基因的巨噬細(xì)胞影響不大。
 
4. Anti-CD40治療可以偏好性激活cDC亞群，誘導(dǎo)Bhlhe40+ Th1類似細(xì)胞和CD8+記憶T細(xì)胞的增殖。
   
總結(jié)
研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)探索了結(jié)直腸癌患者的腫瘤微環(huán)境，對(duì)其中的浸潤髓系細(xì)胞進(jìn)行了系統(tǒng)性的刻畫，分析了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的亞群特征、譜系發(fā)育情況。并進(jìn)一步鑒定了在腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞互作中發(fā)揮關(guān)鍵作用的特定髓系細(xì)胞亞群。在此基礎(chǔ)上，研究通過對(duì)小鼠模型的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析，揭示了髓系細(xì)胞靶向治療anti-CSF1R和anti-CD40對(duì)腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞亞群在細(xì)胞組成、細(xì)胞功能、細(xì)胞互作等方面的影響。
 
研究結(jié)合腫瘤患者及小鼠模型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組來研究腫瘤免疫治療，揭示了靶向髓系細(xì)胞免疫治療的潛在機(jī)制，為相關(guān)免疫治療提供了更明確的指導(dǎo)；并為人們研究腫瘤及其他疾病中的免疫細(xì)胞，以及開發(fā)新的臨床檢測與治療方案提供了新的思路。
 
參考文獻(xiàn)
Zhang, L., Li, Z., Skrzypczynska, K. M., et al. (2020). Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer. Cell, 181:442–459.e29.