利用植物脂質(zhì)組學(xué)等技術(shù)研究水稻雄性生殖發(fā)育機(jī)制

花粉壁對(duì)于保護(hù)雄性配子體和受精過(guò)程起著非常重要的作用�；ǚ郾诘闹饕�成分脂質(zhì)一般由孢子體絨氈層合成和轉(zhuǎn)運(yùn)。盡管目前已有不少研究對(duì)與脂質(zhì)生物合成相關(guān)的幾個(gè)因素進(jìn)行了表征，但水稻花粉發(fā)育過(guò)程中脂質(zhì)生物合成的分子機(jī)制仍然不清楚。

2022年6月，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)李雙成/李平教授團(tuán)隊(duì)在Plant Physiology （IF 8.005） 上發(fā)表了題為“SWOLLEN TAPETUM AND STERILITY 1 Is Required for Tapetum Degeneration and Pollen Wall Formation in Rice”的文章。研究發(fā)現(xiàn) SWOLLEN TAPETUM AND STERILITY 1 (STS1) 基因的突變會(huì)導(dǎo)致水稻絨氈層降解延遲和花粉壁形成中止，并結(jié)合植物脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)證實(shí)了STS1是生殖發(fā)育中脂質(zhì)生物合成的重要因子，參與花藥脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。該研究為植物雄性生殖發(fā)育及花藥脂質(zhì)代謝的調(diào)控機(jī)制提供了新的見(jiàn)解，并為雜交水稻育種中雄性育性的人工控制提供了新的靶點(diǎn)。中科新生命參與了該研究中植物脂質(zhì)組學(xué)的相關(guān)工作。

 

 研究材料

水稻花藥

 

 技術(shù)路線

步驟1：表型研究，sts1突變體為雄性不育；

步驟2：細(xì)胞學(xué)分析，sts1突變體水稻絨氈層降解延遲和花粉壁形成中止；

步驟3：脂質(zhì)組學(xué)分析，sts1突變體中與花粉育性相關(guān)的脂質(zhì)組分明顯下調(diào)；

步驟4：轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，與花藥脂質(zhì)生物合成和絨氈層發(fā)育相關(guān)的部分基因的表達(dá)在sts1-1中受到干擾；

步驟5：STS1與OsPKS2和OsACOS12相互作用，調(diào)節(jié)花藥脂質(zhì)生物合成。

 

 研究結(jié)果

1. 表型研究

作者從秈稻品種9311的突變體庫(kù)中分離出兩個(gè)具有等位基因突變的雄性不育突變體（sts1-1和sts1-2）。與野生型（WT）相比，這些突變體顯示正常營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，但沒(méi)有產(chǎn)生可利用的種子。突變體的花藥呈黃白色且比較小，其在抽穗期沒(méi)有產(chǎn)生花粉粒，然而突變體中的胚囊發(fā)育與WT相似。這些結(jié)果表明sts1突變體為雄性不育，且通過(guò)回交實(shí)驗(yàn)證實(shí)不育表型是由單個(gè)隱性突變引起的（圖1）。
 

 

2. 細(xì)胞學(xué)分析

通過(guò)STS1的克隆和功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了STS1在維持雄性育性中的關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步了解STS1在雄性生殖中的作用，作者分析比較了WT和sts1-1之間花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)差異。光學(xué)顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)在階段8a之前，WT和sts1-1之間未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。WT在第8b階段時(shí)絨氈層開(kāi)始凝結(jié)，隨后進(jìn)一步降解，并最終在第12階段消失。而突變體則開(kāi)始表現(xiàn)出輕微腫脹，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)腫脹。在第12階段時(shí)，不完全降解的絨氈層則保留在突變體花藥壁中。盡管突變體的減數(shù)分裂正常，但小孢子在后期逐漸破碎。在第12階段時(shí)，WT小孢子最終發(fā)育成充滿內(nèi)含物的成熟花粉粒。相反，突變體小孢子開(kāi)始塌陷和退化，最終留下空花藥室。作者后續(xù)使用透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）觀察了絨氈層和小孢子的超微結(jié)構(gòu)和發(fā)育情況，與光學(xué)顯微鏡的結(jié)果類似，結(jié)果表明STS1對(duì)于絨氈層發(fā)育和花粉壁的形成是必不可少的（圖2）。
 

 

3.  脂質(zhì)組學(xué)分析

研究發(fā)現(xiàn)STS1編碼一個(gè)含有DUF726結(jié)構(gòu)域的未知蛋白，其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并證實(shí)了STS1具有脂肪酶活性，參與水稻花藥中的脂質(zhì)生物合成。為了進(jìn)一步了解STS1對(duì)脂質(zhì)生物合成的影響，作者采用脂質(zhì)組學(xué)方法分析了WT和突變體花藥中的脂質(zhì)成分。OPLS-DA分析表明， WT和突變體花藥在脂質(zhì)組成上存在顯著差異。接著定量分析了與雄性生殖發(fā)育相關(guān)的不同脂質(zhì)分子，發(fā)現(xiàn)野生型和突變體中鞘磷脂的豐度相當(dāng)，但突變體中脂肪酰、甘油脂、糖脂和甘油磷脂的幾個(gè)脂質(zhì)類別的總含量顯著低于WT。如鑒定到的六種蠟酯種類，其中四種在突變體中下調(diào)。此外，單酰甘油酯（MG）、三酰甘油酯（TG）、磷脂酰膽堿（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）等類別豐度在突變體中也顯著下調(diào)，這些結(jié)果表明STS1參與了花藥中脂質(zhì)生物合成的調(diào)節(jié)（圖3）。

圖3 STS1具有脂肪酶活性，并參與水稻花藥中的脂質(zhì)生物合成

 

4. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

作者使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步了解STS1在花粉發(fā)育中的作用。在突變體花藥中篩選出210個(gè)差異表達(dá)的基因(DEGs)。其中，60個(gè)基因上調(diào)，150個(gè)基因下調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)DEGs顯著富集在孢粉素生物合成、花粉外壁形成、花粉壁組裝等過(guò)程。RT-qPCR分析進(jìn)一步證實(shí)了一些基因參與這些途徑，如在sts1-1花藥7到10的大多數(shù)階段中，CYP703A3、CYP704B2、OsACO12、OsPKS1、OsPKS2等顯著下調(diào)。此外，與絨氈層發(fā)育相關(guān)的基因及花藥特異性基因如EAT1、OsAP37、OsSub42等在sts1-1花藥中均下調(diào)。這些結(jié)果表明，與花藥脂質(zhì)生物合成和絨氈層發(fā)育相關(guān)的許多基因的表達(dá)在sts1-1花藥中受到干擾，證實(shí)了正�；ㄋ幇l(fā)育需要STS1的假設(shè)（圖4）。

 

圖4與花藥脂質(zhì)生物合成和絨氈層發(fā)育相關(guān)的部分基因的表達(dá)在sts1-1中受到干擾 

 

5. STS1與OsPKS2和OsACOS12相互作用

作者使用酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)等技術(shù)研究了與STS1相互作用以介導(dǎo)脂質(zhì)生物合成的可能成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)STS1可與其自身相互作用，此外，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了STS1與介導(dǎo)水稻花藥中脂質(zhì)的生物合成參與花粉發(fā)育的兩種蛋白OsACOS12和OsPKS2有直接相互作用，且OsACOS12和OsPKS2可能不影響STS1的酶活性（圖5）。

 

圖5 STS1與OsPKS2和OsACOS12相互作用

 

 小編小結(jié)

總之，細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)數(shù)據(jù)共同表明，STS1編碼一種含有DUF726的蛋白質(zhì)，具有脂肪酶活性，并且可能通過(guò)與OsACOS12和OsPKS2相互作用，調(diào)節(jié)花藥脂質(zhì)生物合成，對(duì)絨氈層發(fā)育和花粉壁形成至關(guān)重要。

 

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