Smad4對(duì)靜壓力下人牙齦成纖維細(xì)胞基因表達(dá)的影響
正畸治療中其可將壓力轉(zhuǎn)化為生物信號(hào)由胞外傳遞到胞內(nèi)，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列相關(guān)信號(hào)傳遞反應(yīng)，影響牙齦組織改建過程。人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）是牙齦組織的主體細(xì)胞，它們可以接收和傳輸信號(hào)。在過去的幾十年中，盡管許多小組廣泛研究了牙槽骨和牙周膜在壓力下的重建，但牙齦重建的機(jī)制在很大程度上仍未得到探索。
在廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院團(tuán)隊(duì)之前的研究中，發(fā)現(xiàn)靜壓力可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1的表達(dá)和HGFs的增殖。TGF-β是調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的重要生長(zhǎng)因子，然而涉及TGF-β調(diào)控HGFs增殖和凋亡的因子和信號(hào)通路仍然未知。Smad4是TGF-β信號(hào)通路的關(guān)鍵下游因子，起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。在經(jīng)典的TGF-β通路中，激活的Smad2/3和Smad4形成SMAD復(fù)合物，其易位到細(xì)胞核。Smad4被認(rèn)為是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的腫瘤抑制基因。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Smad4通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白來影響細(xì)胞凋亡，例如，Smad4在結(jié)腸癌中的低表達(dá)可以通過促進(jìn)Bcl-2和Bcl-w表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，并降低caspase-3 和caspase-9 的表達(dá)。因此，該團(tuán)隊(duì)假設(shè)Smad4可能在靜壓力作用下HGFs的增殖和凋亡中起關(guān)鍵作用。
可生物降解聚乳酸-乙醇酸聚合物（PLGA）已成為應(yīng)用zui廣泛的生物支架材料之一。與其他支架材料相比，PLGA具有良好的生物學(xué)特性。與二維培養(yǎng)相比，三維（3D）培養(yǎng)可以更有效地模擬人體內(nèi)部的自然環(huán)境，并提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，該團(tuán)隊(duì)建立了3D HGF-PLGA培養(yǎng)模型，探討Smad4、caspase-3 和Bcl-2在調(diào)控HGFs增殖和凋亡通路中的作用，旨在進(jìn)一步了解正畸牙齦重建的分子機(jī)制。
靜壓力誘導(dǎo)HGFs的增殖
首先，實(shí)驗(yàn)建立了三維PLGA-HGFs培養(yǎng)模型，如圖1。與對(duì)照組（0 h）相比，HGFs在25g/cm2 的靜壓力下作用12、24和48 h后增殖能力顯著提高，24 h達(dá)到峰值。隨后當(dāng)加力至72 h后，HGFs的增殖受到抑制，細(xì)胞活力降低。
圖1 靜壓力負(fù)荷示意圖。
靜壓力降低了 HGFs 中 Smad4 的表達(dá)
Smad4的基因和蛋白表達(dá)在靜壓力作用下顯著下降，在24 h達(dá)到zui低水平。隨后，表達(dá)水平在48 h和72 h 時(shí)升高（圖2）。
圖2 靜壓力以時(shí)間依賴性的方式調(diào)節(jié)HGFs中的Smad4表達(dá)。
HGFs 中 caspase-3 和Bcl-2的表達(dá)隨靜壓力的變化而改變
caspase-3 的基因和蛋白表達(dá)顯著下降，在24 h達(dá)到zui低水平。隨后，其表達(dá)在48 h和72 h 增加。然而，Bcl-2的基因和蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加，24 h達(dá)到峰值。隨后，表達(dá)水平逐漸降低（圖3）。
圖3 靜壓力以時(shí)間依賴性方式調(diào)節(jié)HGFs中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
Smad4 mRNA和蛋白質(zhì)水平評(píng)估
在用Lv-Smad4轉(zhuǎn)染HGFs后72 h，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的表達(dá)效率為~90%。此外，基因和蛋白質(zhì)表達(dá)分析顯示，與Lv-對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，Smad4 mRNA表達(dá)量在Lv-Smad4組顯著上調(diào)（圖4 ）。與空白對(duì)照組相比，Lv-對(duì)照組的Smad4 蛋白表達(dá)量顯著下降，表明慢病毒系統(tǒng)有效遞送外源性Smad4基因。
圖4 用Lv-Smad4轉(zhuǎn)染后人牙齦成纖維細(xì)胞中的Smad4基因和蛋白質(zhì)表達(dá)。
Smad4過表達(dá)抑制靜壓力對(duì)HGFs增殖的影響
CCK-8測(cè)定表明，HGFs的吸光度值隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加（圖5）。前2天，Lv-Smad4組、Lv-對(duì)照組和空白對(duì)照組光密度（OD）值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，從第3天開始，Lv-Smad4組的OD值與Lv-對(duì)照組和空白對(duì)照組相比下降。此外，從第5天開始，3組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，空白對(duì)照組OD值z(mì)ui高，Lv-Smad4組OD值z(mì)ui低。此外，CCK-8結(jié)果顯示Smad4參與了靜壓力誘導(dǎo)的HGFs增殖，如圖5 B。與施加力前相比，Lv-Smad4組在靜壓力24 h后HGFs增殖沒有顯著增加（圖5 B）。相反，在Lv-對(duì)照組和Lv-Smad4組中，連續(xù)靜壓力刺激24 h顯著增加了HGFs增殖（圖5 B）。
圖5 Smad4過表達(dá)抑制靜壓力對(duì)HGFs增殖的影響。
Smad4過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了caspase-3 和Bcl-2在HGFs中的表達(dá)
為了確定Smad4在靜壓力下是否介導(dǎo)caspase-3 和Bcl-2的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)在在HGFs中過表達(dá)Smad4。雖然連續(xù)靜壓力刺激24 h可顯著降低Lv-Smad4組Smad4的表達(dá)，但Smad4表達(dá)量較Lv-對(duì)照組和空白對(duì)照組上調(diào)。此外，與對(duì)照組相比，在有或沒有靜壓力刺激的情況下，Lv-Smad4組Bcl-2和caspase-3 的表達(dá)水平分別下調(diào)和上調(diào)（圖6）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Smad4是HGFs中重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)因子，靜壓力通過下調(diào)Smad4的表達(dá)抑制HGFs細(xì)胞凋亡并促進(jìn)增殖。
圖6 Smad4過表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
綜上所述，Smad4在靜壓力作用下通過調(diào)節(jié)caspase-3 和Bcl-2促進(jìn)HGFs增殖。因此，Smad4可能是正畸治療后預(yù)防牙齦增生的重要靶點(diǎn)。然而，該研究存在某些局限性。例如，僅使用CCK-8測(cè)定分析增殖和凋亡，應(yīng)使用其他方法，例如流式細(xì)胞術(shù)。此外，關(guān)于Smad4的討論僅限于增強(qiáng)Smad4的表達(dá)，隨后的研究應(yīng)該通過沉默Smad4來進(jìn)一步驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)。
參考文獻(xiàn)：Zhao S, Nan L, Wang Y, Wei L, Mo S. Effects of Smad4 on the expression of caspase‑3 and Bcl‑2 in human gingival fibroblasts cultured on 3D PLGA scaffolds induced by compressive force. Int J Mol Med. 2021 Mar;47(3):04858. doi: 10.3892/ijmm.2021.4858. Epub 2021 Jan 26. PMID: 33495811; PMCID: PMC7846422.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33495811/
小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請(qǐng)聯(lián)系小編修正。
微信搜索公眾號(hào)“Naturethink”，了解更多細(xì)胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用。
在廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院團(tuán)隊(duì)之前的研究中，發(fā)現(xiàn)靜壓力可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1的表達(dá)和HGFs的增殖。TGF-β是調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的重要生長(zhǎng)因子，然而涉及TGF-β調(diào)控HGFs增殖和凋亡的因子和信號(hào)通路仍然未知。Smad4是TGF-β信號(hào)通路的關(guān)鍵下游因子，起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。在經(jīng)典的TGF-β通路中，激活的Smad2/3和Smad4形成SMAD復(fù)合物，其易位到細(xì)胞核。Smad4被認(rèn)為是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的腫瘤抑制基因。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Smad4通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白來影響細(xì)胞凋亡，例如，Smad4在結(jié)腸癌中的低表達(dá)可以通過促進(jìn)Bcl-2和Bcl-w表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，并降低caspase-3 和caspase-9 的表達(dá)。因此，該團(tuán)隊(duì)假設(shè)Smad4可能在靜壓力作用下HGFs的增殖和凋亡中起關(guān)鍵作用。
可生物降解聚乳酸-乙醇酸聚合物（PLGA）已成為應(yīng)用zui廣泛的生物支架材料之一。與其他支架材料相比，PLGA具有良好的生物學(xué)特性。與二維培養(yǎng)相比，三維（3D）培養(yǎng)可以更有效地模擬人體內(nèi)部的自然環(huán)境，并提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，該團(tuán)隊(duì)建立了3D HGF-PLGA培養(yǎng)模型，探討Smad4、caspase-3 和Bcl-2在調(diào)控HGFs增殖和凋亡通路中的作用，旨在進(jìn)一步了解正畸牙齦重建的分子機(jī)制。
靜壓力誘導(dǎo)HGFs的增殖
首先，實(shí)驗(yàn)建立了三維PLGA-HGFs培養(yǎng)模型，如圖1。與對(duì)照組（0 h）相比，HGFs在25g/cm2 的靜壓力下作用12、24和48 h后增殖能力顯著提高，24 h達(dá)到峰值。隨后當(dāng)加力至72 h后，HGFs的增殖受到抑制，細(xì)胞活力降低。
圖1 靜壓力負(fù)荷示意圖。
靜壓力降低了 HGFs 中 Smad4 的表達(dá)
Smad4的基因和蛋白表達(dá)在靜壓力作用下顯著下降，在24 h達(dá)到zui低水平。隨后，表達(dá)水平在48 h和72 h 時(shí)升高（圖2）。
圖2 靜壓力以時(shí)間依賴性的方式調(diào)節(jié)HGFs中的Smad4表達(dá)。
靜壓力作用下Smad4在HGFs中的mRNA（A）和（B）蛋白表達(dá)。
HGFs 中 caspase-3 和Bcl-2的表達(dá)隨靜壓力的變化而改變
caspase-3 的基因和蛋白表達(dá)顯著下降，在24 h達(dá)到zui低水平。隨后，其表達(dá)在48 h和72 h 增加。然而，Bcl-2的基因和蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加，24 h達(dá)到峰值。隨后，表達(dá)水平逐漸降低（圖3）。
圖3 靜壓力以時(shí)間依賴性方式調(diào)節(jié)HGFs中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
在壓力下半胱天冬酶-3和Bcl-2的mRNA（A）和（B）蛋白表達(dá)。
Smad4 mRNA和蛋白質(zhì)水平評(píng)估
在用Lv-Smad4轉(zhuǎn)染HGFs后72 h，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的表達(dá)效率為~90%。此外，基因和蛋白質(zhì)表達(dá)分析顯示，與Lv-對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，Smad4 mRNA表達(dá)量在Lv-Smad4組顯著上調(diào)（圖4 ）。與空白對(duì)照組相比，Lv-對(duì)照組的Smad4 蛋白表達(dá)量顯著下降，表明慢病毒系統(tǒng)有效遞送外源性Smad4基因。
圖4 用Lv-Smad4轉(zhuǎn)染后人牙齦成纖維細(xì)胞中的Smad4基因和蛋白質(zhì)表達(dá)。
用Lv-Smad4、Lv-對(duì)照或空白對(duì)照轉(zhuǎn)染后Smad4 mRNA（A）和蛋白（B）的相對(duì)表達(dá)。
Smad4過表達(dá)抑制靜壓力對(duì)HGFs增殖的影響
CCK-8測(cè)定表明，HGFs的吸光度值隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加（圖5）。前2天，Lv-Smad4組、Lv-對(duì)照組和空白對(duì)照組光密度（OD）值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，從第3天開始，Lv-Smad4組的OD值與Lv-對(duì)照組和空白對(duì)照組相比下降。此外，從第5天開始，3組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，空白對(duì)照組OD值z(mì)ui高，Lv-Smad4組OD值z(mì)ui低。此外，CCK-8結(jié)果顯示Smad4參與了靜壓力誘導(dǎo)的HGFs增殖，如圖5 B。與施加力前相比，Lv-Smad4組在靜壓力24 h后HGFs增殖沒有顯著增加（圖5 B）。相反，在Lv-對(duì)照組和Lv-Smad4組中，連續(xù)靜壓力刺激24 h顯著增加了HGFs增殖（圖5 B）。
圖5 Smad4過表達(dá)抑制靜壓力對(duì)HGFs增殖的影響。
（A）慢病毒轉(zhuǎn)染后HGFs的增殖。（B）在壓力作用下HGFs 的增殖。
Smad4過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了caspase-3 和Bcl-2在HGFs中的表達(dá)
為了確定Smad4在靜壓力下是否介導(dǎo)caspase-3 和Bcl-2的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)在在HGFs中過表達(dá)Smad4。雖然連續(xù)靜壓力刺激24 h可顯著降低Lv-Smad4組Smad4的表達(dá)，但Smad4表達(dá)量較Lv-對(duì)照組和空白對(duì)照組上調(diào)。此外，與對(duì)照組相比，在有或沒有靜壓力刺激的情況下，Lv-Smad4組Bcl-2和caspase-3 的表達(dá)水平分別下調(diào)和上調(diào)（圖6）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Smad4是HGFs中重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)因子，靜壓力通過下調(diào)Smad4的表達(dá)抑制HGFs細(xì)胞凋亡并促進(jìn)增殖。
圖6 Smad4過表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
（A）Smad4、（B）半胱天冬酶-3和（C）Bcl-2基因和蛋白質(zhì)在靜壓力下的表達(dá)。
綜上所述，Smad4在靜壓力作用下通過調(diào)節(jié)caspase-3 和Bcl-2促進(jìn)HGFs增殖。因此，Smad4可能是正畸治療后預(yù)防牙齦增生的重要靶點(diǎn)。然而，該研究存在某些局限性。例如，僅使用CCK-8測(cè)定分析增殖和凋亡，應(yīng)使用其他方法，例如流式細(xì)胞術(shù)。此外，關(guān)于Smad4的討論僅限于增強(qiáng)Smad4的表達(dá)，隨后的研究應(yīng)該通過沉默Smad4來進(jìn)一步驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)。
參考文獻(xiàn)：Zhao S, Nan L, Wang Y, Wei L, Mo S. Effects of Smad4 on the expression of caspase‑3 and Bcl‑2 in human gingival fibroblasts cultured on 3D PLGA scaffolds induced by compressive force. Int J Mol Med. 2021 Mar;47(3):04858. doi: 10.3892/ijmm.2021.4858. Epub 2021 Jan 26. PMID: 33495811; PMCID: PMC7846422.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33495811/
小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請(qǐng)聯(lián)系小編修正。
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