使用NanoBiT技術(shù)進行的蛋白質(zhì)相互作用細(xì)胞內(nèi)定位成像實驗

蛋白質(zhì)相互作用（PPI）是指兩種蛋白質(zhì)之間直接物理接觸的反應(yīng)過程。鑒于大多數(shù)細(xì)胞過程都涉及到多種蛋白質(zhì)的共同作用，研究成對或更大群體的蛋白質(zhì)相互作用在藥物開發(fā)和疾病研究等多個研究領(lǐng)域都發(fā)揮著重要作用。在體外環(huán)境下，有多種方法可以檢測蛋白質(zhì)相互作用，但這些體外模型不能準(zhǔn)確還原細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。此外，一些PPI在體檢測方法需要裂解細(xì)胞并使用專門的設(shè)備才能進行定量檢測。

為了克服這些挑戰(zhàn)，Promega開發(fā)了NanoLuc Binary Technology （NanoBiT）。NanoBiT是一種結(jié)構(gòu)互補報告分子系統(tǒng)，可用于PPI的細(xì)胞內(nèi)檢測。它已成功應(yīng)用于藥物篩選、信號傳導(dǎo)分析和病毒感染機制分析等一系列研究領(lǐng)域。該系統(tǒng)由一個LargeBiT（LgBiT；17.6 kDa）和一個Small BiT（SmBiT；11個氨基酸）兩個亞基組成，可分別與待測蛋白融合。若兩個待測蛋白存在相互作用，LgBiT 會和 SmBiT 結(jié)構(gòu)互補形成功能性熒光素酶，從而與底物反應(yīng)產(chǎn)生明亮的發(fā)光信號（圖1）。

圖1. NanoBiT蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)概覽。圖像承蒙Promega提供。
 

NanoBiT的細(xì)胞內(nèi)定位成像

為進行細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核表達，我們將兩種載體對轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中。第一對為非靶向FKBP-SmBiT對照載體和FRB-LgBiT對照載體。第二對為細(xì)胞核靶向NLS¹-FKBP-SmBiT對照載體和FRB-LgBiT對照載體（圖2）。FKBP和FRB會在雷帕霉素刺激下結(jié)合產(chǎn)生發(fā)光信號。

圖2. FKBP/FRB NanoBiT和NLS-FKBP/RRB NanoBiT的細(xì)胞內(nèi)定位。

隨后，我們使用IXplore Live for Luminescence顯微成像系統(tǒng)對表達NanoBiT的HeLa細(xì)胞進行生物發(fā)光成像²。
 

為了定位細(xì)胞核，我們使用Hoechst33342對HeLa細(xì)胞進行了復(fù)染，并在同一顯微鏡上進行熒光成像（圖3）。由于非靶向FKBP/FRB NanoBiT在整個細(xì)胞質(zhì)中擴散，我們在整個HeLa細(xì)胞中都觀察到了生物發(fā)光信號。
 

而NLS-FKBP/FRB NanoBiT的生物發(fā)光信號通過與Hoechst33342熒光信號重疊，被證實位于細(xì)胞核。

圖 3. FKBP/FRB NanoBiT和NLS-FKBP/RRB NanoBiT的細(xì)胞內(nèi)定位。
 

實驗條件：

• 顯微鏡：IXplore Live for Luminescence顯微鏡系統(tǒng)²（圖4）

• 相機：imagEM EM-CCD相機(Hamamatsu Photonics)

• 物鏡：LUCPLFLN60XPH（圖5）

• 成像透鏡：0.35X

• EM增益：1200

• 呋喃嗪濃度：1/200稀釋

• 雷帕霉素最終濃度：30 nM

• 曝光時間：相襯50 ms/生物發(fā)光3 min/熒光100 ms

   

圖4. IXplore Live for Luminescence顯微鏡系統(tǒng)
 

圖5. LUCPLFLN60XPH及UPLFLN40XPH物鏡
 

圖6顯示了雷帕霉素刺激前后的NLS-FKBP/FRB NanoBiT生物發(fā)光變化情況。雷帕霉素刺激后細(xì)胞核內(nèi)的生物發(fā)光強度增加。這些結(jié)果表明，在雷帕霉素刺激下，F(xiàn)KBP和FRB在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合，這種相互作用引起了NanoLuc的生物發(fā)光。顯微成像使我們能夠觀察到活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞核生物發(fā)光強度變化，從而檢測到雷帕霉素刺激引起的FKBP和FRB的相互作用。

 
實驗條件：

• 載體：NLS-FKBP-SmBiT/FRB-LgBit載體（各50 ng）

• 顯微鏡：IXplore Live for Luminescence顯微鏡系統(tǒng)²

• 相機：imagEM EM-CCD相機(Hamamatsu Photonics)

• EM增益：1200

• 物鏡：UPLFLN40XPH

• 成像透鏡：0.35X

• 曝光時間：相襯50 ms/生物發(fā)光30 s/熒光100 ms

• 延時間隔：40 s
   

使用光度計和生物發(fā)光顯微鏡進行PPI探測

NanoBiT和HiBiT3技術(shù)使我們能夠使用光度計實現(xiàn)高通量PPI檢測，而顯微成像技術(shù)使我們能夠?qū)⑦@些PPI的細(xì)胞內(nèi)定位可視化。將光度計與生物發(fā)光顯微鏡聯(lián)用檢測PPI具有諸多優(yōu)點。

在觀察局部發(fā)生的PPI或其細(xì)胞內(nèi)定位變化時，我們可以先使用顯微成像來確認(rèn)其定位的準(zhǔn)確性，然后再使用光度計進行高通量測量。該系統(tǒng)無需額外熒光成像便可確認(rèn)細(xì)胞內(nèi)定位。我們可以使用表達NanoBiT或HiBiT的同一構(gòu)建細(xì)胞系來檢查細(xì)胞內(nèi)定位和高通量光度計探測。
 

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致謝

本應(yīng)用說明的作者是Taro Hayashi，Evident生物工程、高級光學(xué)生物工程、研究與開發(fā)研究員。

1.細(xì)胞核定位信號（我們使用了3倍重復(fù)細(xì)胞核定位信號）。

2.基于IXplore Live顯微鏡的生物發(fā)光成像系統(tǒng)。該系統(tǒng)是根據(jù)日本大阪大學(xué)長井教授、Tokai Hit., Co, Ltd.及Evident聯(lián)合開發(fā)的成果設(shè)計的。這項工作是在日本科學(xué)技術(shù)振興機構(gòu)開發(fā)先進測量和分析系統(tǒng)的計劃下完成的。

3.用于通過使用11個氨基酸肽標(biāo)簽(HiBiT)和大約18 kDa NanoLuc熒光素酶片段(LgBiT)的生物發(fā)光探測靶蛋白的HiBiT技術(shù)。
 

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