體視鏡落射熒光照明圖解

研究者已經(jīng)可以在配有高數(shù)值孔徑物鏡的顯微鏡上搭配熒光觀察方法。隨著生物特異性的熒光蛋白（如綠色熒光蛋白，GFP）的出現(xiàn)，熒光觀察也開(kāi)始出現(xiàn)在體視鏡上。
 

       由于體視鏡的視野及工作距離大，通過(guò)體視鏡熒光照明，研究者可以分辨出表達(dá)熒光蛋白的生物，如線(xiàn)蟲(chóng)，斑馬魚(yú)，卵母細(xì)胞，成熟的昆蟲(chóng)等。同時(shí)，研究者們可使用鑷子、滴管或其他顯微操作設(shè)備來(lái)處理樣品。另外，在體視鏡下，體視熒光照明更利于樣品的觀察記錄。

     體視鏡的熒光照明器與復(fù)合式顯微上的相同。熒光照明器中有氙燈或汞燈作為光源，外罩一個(gè)燈室，燈室通過(guò)垂直照明器與顯微鏡機(jī)身相連。如Figure1,2，垂直照明器位于機(jī)身的變倍體與觀察筒之間。

       下面我們以Nikon SMZ1500體視鏡為例，介紹下體視熒光的光路。

       由光源發(fā)出的光經(jīng)過(guò)匯聚透鏡到達(dá)濾色塊組中的激發(fā)光濾光片，在這里，光源中的光只有一部分（某段特定的波長(zhǎng)）能夠通過(guò)濾片。透過(guò)濾片的光被半透半反鏡反射，經(jīng)過(guò)機(jī)身下部的變倍體透鏡組，物鏡，到達(dá)樣品。半透半反鏡的具有反射小于特定波長(zhǎng)的光，而使大于特定波長(zhǎng)的光透過(guò)的特性。

       透過(guò)物鏡的光已倒錐形照射到樣品上，激發(fā)與之相應(yīng)的熒光物質(zhì)。發(fā)射出的熒光透過(guò)物鏡，中間變倍體，到達(dá)發(fā)射光濾光片；在這里，又會(huì)有一部分光被濾掉，只有被激發(fā)出的熒光會(huì)通過(guò)發(fā)射光濾光片。Figure1,2 中顯示的為光路構(gòu)想圖。左側(cè)的光路中，發(fā)射出的熒光直透過(guò)達(dá)發(fā)射光濾光片，然后進(jìn)入相機(jī)或目鏡觀察筒；右側(cè)的光路中的發(fā)射光要先透過(guò)過(guò)半透半反鏡，再透過(guò)發(fā)射光濾光片，進(jìn)入目鏡觀察筒。

       Figure2,3為熒光濾色塊組示意圖。每個(gè)濾色塊組有一個(gè)半透半反鏡，一個(gè)激發(fā)光濾光片，兩個(gè)發(fā)射光濾光片。如前面介紹的，由光源發(fā)出的光透過(guò)激發(fā)光濾光片進(jìn)入濾色塊組，被半透半反鏡反射；發(fā)射出的熒光透過(guò)發(fā)射光濾光片進(jìn)入目鏡或相機(jī)。在這一組合中，半透半反鏡以及左側(cè)的發(fā)射光濾光片是固定在架子上的，而右側(cè)的發(fā)射光濾光片則安裝在一個(gè)可以拆卸的濾片框內(nèi)。只要松動(dòng)螺絲，就可以拆下右側(cè)的濾片框，然后根據(jù)需要，更換半透半反鏡。更換時(shí)需要注意，不要把固定用的膠水，涂到半透半反鏡上，操作要帶手套，避免將指紋留在鏡面上。

       上述體視鏡可搭配3各熒光濾色塊，以及一個(gè)用于明場(chǎng)觀察的無(wú)濾片塊。觀察時(shí)，可通過(guò)拉動(dòng)杠桿調(diào)節(jié)濾色塊的位置，每一個(gè)濾色塊配有不同的標(biāo)識(shí)，便于選擇。

        Table1中為Nikon提供的多種濾色片組合。這些濾色片涵蓋了熒光激發(fā)/發(fā)射的大部分波長(zhǎng)范圍（激發(fā)波段380nm-510nm的染料都適用），適用于生物學(xué)研究及工業(yè)研究。同時(shí)，下列組合也適用于綠色熒光蛋白變種的研究，如cyan及藍(lán)色熒光蛋白。在活細(xì)胞觀察中，選擇適當(dāng)?shù)臑V色片組合會(huì)提高信號(hào)的強(qiáng)度。另外，考慮到葉綠素的自發(fā)熒光，當(dāng)選擇為植物觀察特別設(shè)計(jì)的濾片組。
 

    體視鏡熒光濾片組合:

     
       長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度光照及紫外線(xiàn)照射將會(huì)對(duì)濾色片造成損害，另外，環(huán)境的濕度也會(huì)對(duì)濾片的帶通造成影響。為了延長(zhǎng)濾片的使用壽命，應(yīng)該將濾片儲(chǔ)存在干燥器中，或者放置在有干燥器的密封箱內(nèi)。同時(shí)，應(yīng)當(dāng)減少濾片的曝光的時(shí)間，如不觀察的時(shí)候應(yīng)該關(guān)閉光源的光閘，保護(hù)濾片。清潔濾片時(shí)應(yīng)使用洗耳球、駝毛刷，或無(wú)油的氣體加壓器通過(guò)干燥的空氣進(jìn)行清潔。千萬(wàn)不可以使用擦鏡紙，它們會(huì)劃傷濾片上的鍍膜。

       以Nikon SMZ1500為例，這款體視鏡的放大倍數(shù)為4x到540x，接近一臺(tái)復(fù)合式顯微鏡的放大倍數(shù)。研究者可以通過(guò)這樣的體視鏡觀察大體積的活樣品，或經(jīng)熒光標(biāo)記的薄切片。Figure4為三色熒光染色的小鼠腎臟切片。使用的染料分別為DAPI, Alexa Fluor 488 WGA, 及 Alexa Fluor 568，相應(yīng)的濾色片為T(mén)able1中的Blue GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, 及 TRITC DsRed。這張圖片體現(xiàn)了體視鏡具備了觀察復(fù)合式顯微鏡樣品的能力。
 

       其他顯微鏡制造商有著不同的提示熒光照明設(shè)計(jì)，如Figure5中為比較主流的模式之一。在這一設(shè)計(jì)中，有一個(gè)獨(dú)立于成像光路的熒光照明通道。由光源發(fā)出的光首先經(jīng)過(guò)激發(fā)光濾色片，然后通過(guò)主機(jī)后方的通道到達(dá)底部的透鏡組，這些透鏡組將光傳導(dǎo)到樣品上。這樣的設(shè)計(jì)保證了無(wú)論在何種放大倍數(shù)下，激發(fā)光都會(huì)直接照射在樣品上，范圍，發(fā)射光強(qiáng)度，黑背景都不隨放大倍數(shù)改變。發(fā)射出的熒光通過(guò)物鏡到達(dá)變倍體后，透過(guò)發(fā)射光濾光片，進(jìn)入目鏡用于觀察或進(jìn)入相機(jī)。這一設(shè)計(jì)主要的優(yōu)勢(shì)在于取消了半透半反鏡，并且濾片的組合可變，研究者可選的范圍很大。然而，這也帶來(lái)了相應(yīng)的問(wèn)題，如，沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的操作者可能會(huì)因?yàn)檫x擇了錯(cuò)誤濾片組合而觀察不到熒光。
 

       由汞燈產(chǎn)生的強(qiáng)紫外線(xiàn)會(huì)損傷觀察者的視網(wǎng)膜。許多廠(chǎng)家為了避免這一事故都引用了保護(hù)設(shè)施濾掉照射在樣品及載物臺(tái)上的紫外線(xiàn)。同時(shí)還有很多其他的保護(hù)措施，如在光路中加入濾片。體視熒光鏡中通常在燈箱及垂直照明器之間裝有光閘，當(dāng)不觀察樣品或不照相時(shí)，光閘將會(huì)關(guān)閉，以保護(hù)樣品不受長(zhǎng)時(shí)間紫外線(xiàn)的傷害。有時(shí)在高倍平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡（1.6x至2.0x）配合低變倍比的情況下，視野里較低的部分可能會(huì)出現(xiàn)反射及hot spots現(xiàn)象。這一假象通常在調(diào)高變倍比時(shí)消失。而且在使用低放大倍數(shù)物鏡（0.5x或1.0x）以及高放大倍數(shù)低校正物鏡（消色差物鏡，平場(chǎng)消色差物鏡）時(shí)不會(huì)出現(xiàn)這一假象。使用體視鏡可以觀察很多種樣品，如Table2,從生物到工業(yè)制造。
 

       體視鏡熒光的應(yīng)用

       
      與復(fù)合式顯微鏡相比，大工作距離及景深使體視熒光能夠提供全景信息并觀察高強(qiáng)度熒光。這些特性為研究者們帶來(lái)了很多便利，比如可以操作大的生物樣品，或者材料技術(shù)師可在此進(jìn)行包埋，檢查電子元件，或切割�，F(xiàn)在特殊用途的濾片組合越來(lái)越豐富，體視熒光鏡也將得到更好的發(fā)展。
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