細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中的給藥劑量和注意事項(xiàng)
小白：拿到產(chǎn)品后都不知所措了，之前拿到的產(chǎn)品一不小心就選錯(cuò)了溶劑，直接廢掉不能用了，扔掉的都是白花花的經(jīng)費(fèi)啊。
師兄：拿到產(chǎn)品不能想當(dāng)然的就動(dòng)手，要多查資料查文獻(xiàn)。科學(xué)研究一切都是要有理有據(jù)有出處的，即使沒有相關(guān)文獻(xiàn)也是需要查閱大量相似資料奠定理論基礎(chǔ)，設(shè)置梯度來摸索的。一切都是不容易的。
萌 Cece：給藥是個(gè)大工程，需要大量的理論基礎(chǔ)和文獻(xiàn)參考，只有站在巨人的肩上，我們才能看的更遠(yuǎn)，走的更久
不同的產(chǎn)品，不同的給藥方式和給藥劑量，即使是同一產(chǎn)品，不同的細(xì)胞，不同動(dòng)物模型，給藥劑量也是不一樣的。拿到產(chǎn)品后，我們要根據(jù)產(chǎn)品名字和自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，有目的的去查文獻(xiàn)。
■ 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，劑量如何查詢
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一般是將小分子藥物加入培養(yǎng)基，與細(xì)胞共孵育來發(fā)揮作用的。給藥劑量查詢?nèi)缦滤荆?/span>輸入產(chǎn)品名字，細(xì)胞系名稱，劑量單位(小分子抑制劑一般用量在 µM 的比較多，重組蛋白類的一般用量在 ng/mL 的范圍)，文獻(xiàn)搜索后，參考文獻(xiàn)的使用濃度和使用時(shí)間，設(shè)計(jì)自己的實(shí)驗(yàn)。
Tips: 也會(huì)有小伙伴遇到自己的細(xì)胞系沒對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)的情況，建議根據(jù)其他細(xì)胞系文獻(xiàn)的使用劑量，設(shè)置梯度進(jìn)行 “劑量-效應(yīng)” 曲線預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定合適的使用濃度再進(jìn)行后續(xù)的功能研究。
圖 1. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)查閱
■ 當(dāng)小分子抑制劑遇到轉(zhuǎn)染
當(dāng)然，并不是所有的劑量組都只有小分子化合物，有些伙伴可能會(huì)糾結(jié) “我還要給細(xì)胞轉(zhuǎn)染，這個(gè)時(shí)候我要怎么加藥呢？” “除了小分子抑制劑，我要加我自己合成的其他藥物，該是怎樣怎么加藥呢？”
如下面這篇文章里，作者團(tuán)隊(duì)探究 κ 阿片受體 (KOR) 在 食管鱗狀細(xì)胞癌 (ESCC) 中的作用及其潛在機(jī)制，研究者前期使用 siRNA 敲低 KOR 表達(dá)，發(fā)現(xiàn) KOR 下調(diào)增強(qiáng)了 ESCC 細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力。激活 PI3K -Akt 通路對(duì)腫瘤細(xì)胞（經(jīng) siRNA 敲低 KOR 表達(dá)處理）的增殖有促進(jìn)作用，為探究 AKT 的激活是否是導(dǎo)致轉(zhuǎn)染 siRNA-KOR 的腫瘤細(xì)胞的增殖、入侵和遷移的原因，使用小分子抑制劑 HY-10249A (0.5 μM) 對(duì)其進(jìn)行處理[1]。
注意文獻(xiàn)這里的描述：“following KOR knockdown”，小分子抑制劑是在轉(zhuǎn)染之后加的，HY-10249A ，AKT 激酶抑制可以逆轉(zhuǎn) KOR 的抑制對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。
圖 2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)查閱
圖 3. AKT 激酶抑制可以逆轉(zhuǎn) KOR 的抑制對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響[1]
敲黑板: 請(qǐng)注意，這里是案例，實(shí)際給藥還需多多參考文獻(xiàn)！
關(guān)注關(guān)注文獻(xiàn)中的 Method 部分，搜索關(guān)鍵字以及做好整理。
搜關(guān)鍵字以及做好整理。常見關(guān)鍵字 Pretreatment，co-treatment, following, before treatment 等等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的給藥方式包括口服，灌胃，注射 (皮下注射，皮內(nèi)注射，靜脈注射，腹腔注射，肌肉注射等)，具體可參考小 M 的往期推文：給藥方式猶豫不決？不看你就虧了。
在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥之前，首先明確自己的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，再用關(guān)鍵字查閱文獻(xiàn)選擇合適的給藥方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。如下所示：
在查閱文獻(xiàn)的網(wǎng)站搜索框中輸入產(chǎn)品名稱，動(dòng)物模型，劑量單位(小分子類產(chǎn)品一般 mg/kg 較多)，搜索文獻(xiàn)，搜到文獻(xiàn)后參考文獻(xiàn)劑量設(shè)置梯度進(jìn)行就可以啦！
還是以 LY294002 為案例，假設(shè)你用的小鼠是 BALB/c 小鼠，準(zhǔn)備做乳腺癌相關(guān)研究，那么你可以關(guān)鍵字可以這樣設(shè)置！“LY294002 breast tumor BALB/c mg/kg” 或者 “LY294002 breast cancer BALB/c mg/kg”。
好了，查到大量文獻(xiàn)后，請(qǐng)進(jìn)入閱讀學(xué)習(xí)模式！
圖 4. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)查閱
還有這樣一種情況，可能你查到的文獻(xiàn)都是小鼠，但實(shí)際你要做的是大鼠，但是找不到文獻(xiàn)支持，下面策略可以考慮:
匯總好查閱的關(guān)于小鼠的給藥劑量的文獻(xiàn)。
使用常見物種給藥劑量的相互換算，如下表 1 所示，根據(jù)公式 Animal rat (mg/kg) = Animal mouse (mg/kg) multiplied by (Animal mouse Km/Animal rat Km)。即大鼠體內(nèi)的給藥劑量為小鼠給藥劑量的一半 (請(qǐng)注意，嚴(yán)謹(jǐn)起見，設(shè)置濃度梯度劑量組)[2]。
實(shí)驗(yàn)方案確定好了之后，下一步就是藥物溶解了。
■ 友好溶劑：水
水溶性的產(chǎn)品，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)可以用純 ddH2O 配置 20-100 倍的儲(chǔ)液，使用時(shí)培養(yǎng)基稀釋到工作液濃度后 0.22 µm 濾膜過濾。
■ 溶解界老大哥：萬能溶劑 DMSO
很多產(chǎn)品并不溶于水，這時(shí)候，我們的萬能溶劑 DMSO 就閃亮登場(chǎng)了。
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以根據(jù)您的最大使用濃度，配置 1000X 的儲(chǔ)液，使用時(shí)培養(yǎng)基稀釋到工作液濃度。
Tips: 有時(shí)候可能會(huì)遇到產(chǎn)品本身溶解度不高的情況，無法配置 1000X 的儲(chǔ)備液；要做好溶劑對(duì)照，排除下 DMSO 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。
但溶劑的選擇，也不能想當(dāng)然是 DMSO，前切記切記多看說明書。
注：MCE 說明書的溶解方案都是實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)。有些產(chǎn)品很有可能是萬能溶劑也溶解不了，番茄紅素為例，它的溶劑是 THF 四氫呋喃。此外，其他有機(jī)溶劑 DMF (鉑類物質(zhì)的好朋友)，丙酮等，雖相對(duì) DMSO 使用較少，但它們還是藥物溶解的好溶劑！見往期推文：溶劑大比拼—細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篇。
■ 友好溶劑：水或者生理鹽水
您如果選擇 PBS 或生理鹽水配置，溶解度參考水中的溶解信息，配置好后 0.22 µm濾膜過濾，直接使用不可儲(chǔ)存。因 PBS 或生理鹽水的成分相對(duì)復(fù)雜，長(zhǎng)期儲(chǔ)存不確定是否會(huì)影響產(chǎn)品活性，所以不建議用 PBS 或生理鹽水陪住儲(chǔ)液。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，您可以根據(jù)水中的溶解度信息，選擇用雙蒸水配置 10 倍的儲(chǔ)液，使用時(shí) PBS 或生理鹽水稀釋 10 倍；如果溶解度受限，無法配置 10X 的水中溶解度，需用 PBS 或生理鹽水現(xiàn)配現(xiàn)用。
■ 對(duì)于有機(jī)溶劑溶解的產(chǎn)品（如 DMSO）
正常小鼠可用 DMSO 配置至少 10 倍的儲(chǔ)液，使用時(shí)加助溶劑稀釋 10 倍，做好溶劑對(duì)照就可以了。
在這里給大家安利一個(gè)小工具！進(jìn)入公眾號(hào)打開 “實(shí)用工具-溶解度計(jì)算器”，輸入產(chǎn)品貨號(hào)，輸入小鼠體重，給藥體積，小鼠數(shù)量以及給藥周期：
■ 免疫缺陷鼠，如裸鼠，NGS 小鼠等體弱小鼠，一般建議配置至少 50X 的儲(chǔ)液。
可能有小伙伴要問：50X，這是什么意思？此處以Rapamycin (HY-10219) 為例，一般小鼠體內(nèi)的給藥劑量在 1-10 mg/kg。假設(shè)給藥 8 mg/kg [3]，小鼠體重為 20 g，腹腔注射，200 µL 的給藥體積。
我們最終的工作液濃度是 0.8 mg/mL，50X，就是配置 40 mg/mL 的儲(chǔ)液 (此產(chǎn)品在 DMSO 中的溶解度為 125 mg/mL，可以滿足），使用時(shí)按照 2% DMSO+40% PEG300+5% Tween 80+53% saline 稀釋給藥。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，有些模型給藥劑量較大，可能無法配置 10X 或者 50X 儲(chǔ)備液，那么需要考慮現(xiàn)配現(xiàn)用的方案，比如 0.5% CMC-Na/saline (HY-Y0703），50% PEG 300 (HY-Y0873) +50% saline 等方案可選 (詳見往期推文：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)溶劑大 Battle！)。
但無論哪種實(shí)驗(yàn)方案，建議使用前先取少量嘗試，能達(dá)到澄清溶液或均勻的混懸液，腹腔和口服給藥都是可以的。
生物實(shí)驗(yàn)是一個(gè)不斷摸索和嘗試的過程，給藥劑量，給藥方式，溶解方案等都是要在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上摸索，這樣才能達(dá)到事半功倍的效果。以上是萌 Cece 對(duì)溶解，給藥等的一些建議，僅供參考。
最后，萌 Cece 祝大家實(shí)驗(yàn)順利，paper 多多~
參考文獻(xiàn)
[1] Cell Commun Signal. 2022;20(1):35. Published 2022 Mar 19.
[2] Arch Physiol Biochem. 2022 Apr;128(2):426-430. PMID: 31746232.
[3] Elife. 2016 Aug 23;5:e16351.PMID: 27549339.
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