SCIEX在PROTAC藥物定量分析中的解決方案

PROTAC即靶向蛋白降解嵌合體(Proteolysis-Targeting Chimeras)，是一種利用泛素-蛋白酶系統(tǒng) (Ubiquitin-Proteasome System, UPS) 對(duì)靶蛋白進(jìn)行降解的藥物開(kāi)發(fā)技術(shù)。PROTAC是一個(gè)兩端含有不同配體的化學(xué)分子，一端是結(jié)合E3連接酶的配體，另一端是結(jié)合細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的配體，這兩個(gè)配體再由一段連接子連接起來(lái)。這樣的化學(xué)分子既可以結(jié)合E3泛素連接酶，又可以結(jié)合細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，通過(guò)把靶向的蛋白質(zhì)招募到E3泛素連接酶附近來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向蛋白質(zhì)的多泛素化，最后被蛋白酶體降解。

PROTAC的特點(diǎn)是可以循環(huán)使用，而不被蛋白酶體降解。在患者體內(nèi)，PROTAC的靶蛋白配體和靶蛋白結(jié)合，E3泛素連接酶配體和細(xì)胞內(nèi)的E3泛素連接酶的底物結(jié)合區(qū)結(jié)合，從而通過(guò)連接子把靶蛋白拉進(jìn)到E3泛素連接酶旁邊，實(shí)現(xiàn)UPS系統(tǒng)將靶蛋白降解^[1]。

傳統(tǒng)小分子需要知曉靶蛋白的內(nèi)在位點(diǎn)和機(jī)制來(lái)結(jié)合然后起效，而PROTAC則不用重視靶蛋白本身機(jī)制，無(wú)需競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)，只要結(jié)合上就直接將靶蛋白泛素化標(biāo)記后降解^[2]。由于它的機(jī)制特殊，僅需要少量就可發(fā)揮藥效，用量常常是納摩爾級(jí)別，這也給它的安全性和活性評(píng)價(jià)帶來(lái)一定難度。

SCIEX已開(kāi)發(fā)多種PROTAC類(lèi)藥物的血漿基質(zhì)定量方案，本文將介紹其中的兩種。
 

ARV-110 (Bavdegalutamide)是一種治療轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌的PROTAC藥物，目前的報(bào)道顯示其在臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)出持續(xù)的抗腫瘤活性和患者獲益證據(jù)。

本方法采用沉淀蛋白后再吹干復(fù)溶的方式進(jìn)行血漿前處理，通過(guò)SCIEX Triple Quad^™ 系統(tǒng)對(duì)大鼠血漿中ARV-110進(jìn)行直接定量分析，在血漿基質(zhì)中定量下限LLOQ可達(dá)5 pg/mL（圖1），方法選擇性好，靈敏度高。ARV-110化合物的回歸方程和線性范圍見(jiàn)圖2，ARV-110在5~5000 pg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
 

圖1. ARV-110在空白血漿、5 pg/mL、10 pg/mL、
20 pg/mL和50 pg/mL大鼠血漿基質(zhì)中峰圖信息。
 

圖2. ARV-110的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性圖譜，
線性范圍5~5000 pg/mL，線性相關(guān)系數(shù) r=0.998
 

GNE-987是一種降解溴結(jié)構(gòu)域蛋白4 (BRD4) 的PROTAC，由VHL配體、BRD4配體與間隔基團(tuán)組成，具有皮摩爾級(jí)別的BRD4降解活性，所以這也給它的安全性和活性評(píng)價(jià)帶來(lái)了一定難度。

本方法采用甲基叔丁基醚萃取后再用氮?dú)獯蹈刹��?fù)溶的方式進(jìn)行血漿前處理，通過(guò)SCIEX Triple Quad^™ 系統(tǒng)對(duì)大鼠血漿中PROTAC藥物GNE-987進(jìn)行直接定量分析。方法前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，定量下限LLOQ可達(dá)2 pg/ml（圖3），濃度范圍在2 pg/ml ~ 10 ng/ml呈良好的線性關(guān)系（圖4）。
 

圖3. GNE-987在空白血漿和
不同濃度血漿樣品中的峰圖信息
 

圖4. GNE-987的線性關(guān)系圖

參考文獻(xiàn)
1. Louise M. Sternicki, Jim Nonomiya, Miaomiao Liu, et al. Native Mass Spectrometry for the Study of PROTAC GNE-987-Containing Ternary Complexes [J]. Chem Med Chem, 2021, 16, 1-6.

2. Lawrence B. Snyder, ArvinasInc, New Haven, CT. Discovery of ARV-110, a first in class androgen receptor degrading PROTAC^® for the treatment of men with metastatic castration resistant prostate cancer. www.arvinas.com