Nature子刊文獻(xiàn)解讀：揭示不依賴配體的STING信號激活

cGAS-STING通路是人類先天免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵組成部分，在感染、癌癥、自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要作用。通常認(rèn)為cGAS-STING通路的激活是一種“觸發(fā)-釋放”機(jī)制，也就是說在檢測到微生物DNA或環(huán)狀二核苷酸時激活，引發(fā)I型干擾素（IFN）反應(yīng)。若沒有致病配體存在，這一通路是否會被激活，目前還不大清楚。

近日，德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心團(tuán)隊深入分析了穩(wěn)態(tài)下的cGAS-STING信號傳導(dǎo)。研究者發(fā)現(xiàn)，STING在穩(wěn)態(tài)下不斷從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，之后繼續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體。若從高爾基體到溶酶體（即后高爾基體）的轉(zhuǎn)運(yùn)被中斷，則會延長STING在高爾基體的停留時間并激活I(lǐng)FN信號。

這項研究成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上，提出了一種不依賴配體的cGAS-STING信號的“本底流動”機(jī)制，可在后高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)水平上進(jìn)行調(diào)控，并有望應(yīng)用于癌癥免疫治療。
 

圖片來源：Nature Communications
（https://doi.org/10.1038/s41467-022-33765-0）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF），通過siRNA敲低了多個基因的表達(dá)，并利用CRISPR/Cas9技術(shù)生成了基因敲除細(xì)胞系。研究者還使用了多種基因敲除小鼠，其中Gcc2^+/−和Rab14^+/-小鼠由賽業(yè)生物提供。除了敲除后的基因表達(dá)分析，研究者還采用熒光共聚焦顯微鏡觀察了STING的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

技術(shù)路線
01 中斷STING的后高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)會選擇性激活I(lǐng)FN信號
02 轉(zhuǎn)運(yùn)中斷導(dǎo)致STING在高爾基體內(nèi)長時間停留，導(dǎo)致IFN信號增強(qiáng)
03 基因敲除分析證實，STING的后高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)由GCC2和Rab14等輔因子調(diào)控
04 Gcc2和Rab14的敲除可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力，并抑制小鼠的腫瘤生長

研究結(jié)果
1.GCC2調(diào)控了STING的高爾基體排出
為了全面分析STING轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的所有主要細(xì)胞器上的輔因子，研究人員建立了一張候選輔因子的空間圖，并通過siRNA敲除對其進(jìn)行功能驗證。在不依賴配體（tonic）的激活分析中，研究者發(fā)現(xiàn)，選擇性中斷高爾基體排出（Golgi-exit）或后高爾基體（post-Golgi）的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)會意外地激活先天免疫信號。

研究者之后比較了有代表性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輔因子SEC24C和后高爾基體輔因子GCC2。GCC2是一種參與后高爾基體囊泡分揀的卷曲螺旋蛋白，以往沒有與STING信號通路相關(guān)聯(lián)。

與對照組相比，野生型MEF中Gcc2的敲低明顯增加了干擾素基因Ifnb1和干擾素刺激基因Ccl4的本底表達(dá)，而Sec24c的敲低則沒有影響。共聚焦顯微鏡分析顯示，Gcc2敲低破壞了高爾基體排出，導(dǎo)致DNA刺激后STING在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中積累。這些結(jié)果表明，STING的高爾基體排出是由GCC2及其他后高爾基體輔因子調(diào)控的。

為了進(jìn)一步分析GCC2的功能，研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)生成了Gcc2^KO MEF。與Gcc2^WT MEF相比，Gcc2^KO MEF中的IFN基因和干擾素刺激基因（ISG）的本底表達(dá)增加。在HSV-1-GFP感染后，Gcc2^KO細(xì)胞產(chǎn)生了更高水平的IFNβ，且病毒復(fù)制和病毒滴度下降（圖1）。這些數(shù)據(jù)證實，GCC2是STING信號傳導(dǎo)中一個重要的負(fù)調(diào)控因子，在靜息狀態(tài)和配體刺激后，它都能介導(dǎo)STING從高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體進(jìn)行降解。

利用定量延時共聚焦顯微鏡來分析STING轉(zhuǎn)運(yùn)后，研究者發(fā)現(xiàn)在Gcc2^KO細(xì)胞中，STING在高爾基體的停留時間與Gcc2^WT細(xì)胞相比明顯增加，而且STING激活的關(guān)鍵標(biāo)志物（p-TBK1和p-IRF3）活性更高，這表明STING在高爾基體的長時間停留招募了更多TBK1和IRF3并磷酸化，從而增強(qiáng)IFN信號（圖1）。由此可見，GCC2調(diào)控了STING高爾基體排出，而Gcc2^KO同時增強(qiáng)了不依賴配體和依賴配體的STING信號傳導(dǎo)。
 

GCC2是STING的高爾基體排出所必需的^[1]

以往的研究發(fā)現(xiàn)，將細(xì)胞培養(yǎng)溫度從37°C降低到20°C可以減緩高爾基體的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，那么這是否會增強(qiáng)STING信號？研究人員發(fā)現(xiàn)，與37°C培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在20°C下培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)且更持久的STING信號傳導(dǎo)活動，且STING在高爾基體中停留的時間明顯延長。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了高爾基體排出是減弱STING信號傳導(dǎo)的一個關(guān)鍵檢查點(diǎn)。

2.cGAS驅(qū)動不依賴配體的STING轉(zhuǎn)運(yùn)
之后，研究人員探索了Gcc2^KO細(xì)胞中的STING轉(zhuǎn)運(yùn)和信號傳導(dǎo)是由什么驅(qū)動的？研究者發(fā)現(xiàn)，Gcc2^KO細(xì)胞的先天免疫激活離不開cGAS和STING。通過突變分析發(fā)現(xiàn)在Gcc2^KO細(xì)胞中，cGAS的DNA結(jié)合和酶活是細(xì)胞固有的先天免疫激活所必需的，而cGAMP結(jié)合和STING磷酸化也是必不可少的。進(jìn)一步分析顯示，Gcc2^KO通過中斷轉(zhuǎn)運(yùn)來增強(qiáng)STING信號，而沒有進(jìn)一步激活cGAS。利用cGas^-/-小鼠組織開展的分析顯示，cGAS在穩(wěn)態(tài)下正常運(yùn)作，它促進(jìn)STING信號傳導(dǎo)，以維持免疫防御的本底狀態(tài)。

3.RAB14等蛋白介導(dǎo)STING的后高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)
以往發(fā)現(xiàn)，在“貨物”運(yùn)出高爾基體后，不同的Rab GTP酶會“蓋上郵戳”，分揀到不同的目的地。那么，在STING的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，哪些Rab負(fù)責(zé)“蓋郵戳”？研究者發(fā)現(xiàn)，STING與多個Rab有著強(qiáng)的相互作用，包括Rab2b、Rab6b、Rab9a和Rab14。

其中，在敲低Rab14后，幾種ISG的本底表達(dá)明顯升高（圖2）。與Rab14^WT MEF相比，Rab14^KO MEF中的STING蛋白水平更高，且STING在高爾基體中的停留時間增加。Rab14^KO與Gcc2^KO的表型相似，這表明由Gcc2-Rab14調(diào)控的STING高爾基體排出對免疫信號傳導(dǎo)至關(guān)重要。
 

RAB14及其他Rab介導(dǎo)了STING的后高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)^[1]

4.Gcc2^KO和Rab14^KO誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力
接下來，研究人員開展體內(nèi)分析，以評估中斷STING后高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的生理后果。Rab14^−/−小鼠是胚胎致死的，因此實驗在Gcc2^−/−小鼠身上開展。6個月大的Gcc2^−/−小鼠對各種自身免疫性疾病的常見抗原的IgM自身抗體水平明顯升高。重要的是，Gcc2^−/−Sting^−/−小鼠的這些自身抗體則完全恢復(fù)到野生型水平。由此可見，Gcc2缺乏會在小鼠中誘導(dǎo)STING依賴性的自身免疫。

STING信號的激活會誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力，于是，研究人員敲除B16黑色素瘤細(xì)胞中的多個STING轉(zhuǎn)運(yùn)輔因子，并將其植入野生型小鼠體內(nèi)。三個后高爾基體輔因子的敲除（Gcc2、Rab14和Npc1）都抑制了腫瘤生長。Gcc2^KO和Rab14^KO B16腫瘤的生長速度明顯慢于野生型B16腫瘤。這些數(shù)據(jù)顯示，在后高爾基體步驟中中斷cGAS-STING的本底流動可以實現(xiàn)抗腫瘤免疫，在功能上與STING激動劑相似。

研究結(jié)論

整體模型的示意圖^[1]

總的來說，這項研究揭示了STING在穩(wěn)態(tài)下不斷從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，而不是靜止在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。若后高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)被中斷，無論是通過敲除轉(zhuǎn)運(yùn)輔因子還是通過降低溫度，都會延長STING在高爾基體的停留時間，并增強(qiáng)IFN信號（圖3）。作者認(rèn)為，與“快速而猛烈的”STING激動劑相比，這種轉(zhuǎn)運(yùn)中斷也許是激活STING的另一種“緩慢而穩(wěn)定的”模式，在癌癥免疫治療中可能會帶來更有利的結(jié)果。

原文檢索：
[1] Tu, X., Chu, TT., Jeltema, D. et al. Interruption of post-Golgi STING trafficking activates tonic interferon signaling. Nat Commun 13, 6977 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33765-0

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建
賽業(yè)生物分別構(gòu)建了Gcc2基因敲除小鼠與條件性基因敲除小鼠、Rab14基因敲除小鼠與條件性基因敲除小鼠，更有活體小鼠已加入『紅鼠資源庫』，快至2周交付！確保您在短時間內(nèi)獲得更具性價比的實驗用鼠，為您的研究加點(diǎn)速~
 

Gcc2 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Gcc2^em1C/Cya
產(chǎn)品編號：
S-KO-13297
應(yīng)用方向：
生殖系統(tǒng),內(nèi)/外分泌腺,細(xì)胞組成,細(xì)胞定位,生理系統(tǒng),細(xì)胞生物學(xué)

Gcc2 flox小鼠

品系名稱：

C57BL/6J-Gcc2^em1Cflox/Cya

產(chǎn)品編號：

S-CKO-14774

應(yīng)用方向：

生殖系統(tǒng),內(nèi)/外分泌腺,細(xì)胞組成,細(xì)胞定位,生理系統(tǒng),細(xì)胞生物學(xué)

Rab14 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Rab14^em1C/Cya
產(chǎn)品編號：
S-KO-12700
應(yīng)用方向：
神經(jīng)系統(tǒng),信號轉(zhuǎn)導(dǎo),骨骼系統(tǒng),腎和泌尿系統(tǒng),內(nèi)穩(wěn)態(tài)/代謝
 

Rab14 flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Rab14^em1Cflox/Cya
產(chǎn)品編號：
S-CKO-14156
應(yīng)用方向：
神經(jīng)系統(tǒng),信號轉(zhuǎn)導(dǎo),骨骼系統(tǒng),腎和泌尿系統(tǒng),內(nèi)穩(wěn)態(tài)/代謝