WBP全身體積描記系統(tǒng)在肺纖維化研究中的應(yīng)用

 

      全身體積描記系統(tǒng)（whole-body plethysmograph，WBP）可對(duì)清醒自由活動(dòng)動(dòng)物呼吸參數(shù)進(jìn)行測(cè)量，如呼吸頻率，潮氣量，氣道高反應(yīng)性測(cè)試（Airway hyperresponsiveness，AHR）等。測(cè)試過(guò)程中，動(dòng)物可以處于清醒自由狀態(tài)，避免了創(chuàng)傷性氣管切開及麻醉的影響，使實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加簡(jiǎn)便，用于呼吸系統(tǒng)模型動(dòng)物對(duì)藥物等反應(yīng)性研究，呼吸性藥物的藥理和毒理學(xué)研究，特別適合于大批量動(dòng)物快速初篩試驗(yàn)，適合長(zhǎng)期跟蹤研究和重復(fù)性篩查。全身體積描記系統(tǒng)也被應(yīng)用于肺纖維化的研究中。
 
       目前，肺纖維化的發(fā)病率和死亡率逐年增加，同時(shí)，臨床上仍缺乏有效的治療手段。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)包括旁分泌作用、線粒體轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化在內(nèi)的多種機(jī)制治療肺部炎癥并緩解肺纖維化的進(jìn)程。但目前干細(xì)胞治療仍面臨著移植后干細(xì)胞難以監(jiān)測(cè)、在肺部滯留時(shí)間短和存活率低等問(wèn)題。 
      針對(duì)上述問(wèn)題，中國(guó)科學(xué)院上海硅酸鹽研究所陳航榕研究員和馬明副研究員團(tuán)隊(duì)利用“金屬卟啉誘導(dǎo)多尺度自組裝”策略構(gòu)建了一種新型多功能探針，用于輔助干細(xì)胞治療。該復(fù)合探針由具有臨床應(yīng)用潛力的原卟啉氯化鈷（CoPP）、金納米顆粒和超順磁Fe3O4納米顆粒三種功能組分構(gòu)成，并借助無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)實(shí)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞的高效生物正交標(biāo)記。該自組裝納米探針無(wú)需借助額外載體和表面活性劑，可在較低劑量下有效發(fā)揮每個(gè)組分的相應(yīng)功能。具體來(lái)說(shuō)，該納米探針?biāo)�具有的CT造影成像和磁操控兩種功能分別解決了干細(xì)胞在肺部難以監(jiān)測(cè)和滯留時(shí)間短的問(wèn)題；探針在干細(xì)胞微環(huán)境中通過(guò)緩釋抗氧化藥物CoPP有效提高干細(xì)胞的存活率和修復(fù)效果等。通過(guò)進(jìn)一步構(gòu)建肺纖維化小動(dòng)物模型，證實(shí)了相較于單獨(dú)干細(xì)胞治療組，這種多功能自組裝納米探針介導(dǎo)的干細(xì)胞治療能夠顯著緩解纖維化癥狀并促進(jìn)肺功能恢復(fù)，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。   

• 多功能探針的制備示意圖；（b）探針用于標(biāo)記干細(xì)胞和肺纖維化治療應(yīng)用示意圖；（c）碗狀多功能探針的TEM圖像;（d）高角環(huán)形暗場(chǎng)像照片和元素分布圖像；（e）多功能探針標(biāo)記干細(xì)胞后的顯微圖像，紅色箭頭表示細(xì)胞內(nèi)的探針顆粒。 

 

• 博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植

36只雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)1周，隨機(jī)分為6組： (1)對(duì)照，(2) PF，(3) PF +生理鹽水，(4) PF + MSC，(5) PF + ASCP-BCN標(biāo)記MSC，(6) PF + ASCP-BCN標(biāo)記MSC +磁鐵（n = 6）。 用博萊霉素（BLM）誘導(dǎo)肺纖維化。簡(jiǎn)單地說(shuō)，小鼠被麻醉，將BLM（5 mg/kg）溶于100μL無(wú)菌生理鹽水中，通過(guò)氣管插管緩慢注入氣管腔。生理鹽水組小鼠僅給予100μL無(wú)菌生理鹽水。給藥后第7天重復(fù)上述步驟。將未標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞和標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞（每只小鼠1×106個(gè)細(xì)胞）放在100 μL生理鹽水中，在第一次注射BLM后第10天氣管內(nèi)移植到小鼠肺中。在PF + ASCP-BCN標(biāo)記的MSC +磁體組中，每只小鼠的胸部都附著一個(gè)NdFeB磁體。第一次注射BLM后第28天處死小鼠，取肺組織。

• 肺功能評(píng)價(jià)

在第一次注射BLM后的第28天，給小鼠稱重，并將其放入WBP全身體積描記系統(tǒng)中，記錄其肺功能數(shù)據(jù)。然后采集小鼠的肺以進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。取出每只小鼠的一個(gè)肺葉，輕輕擦拭其表面的血液。將肺組織稱重，在60℃下烘烤72 h。再次稱重干肺組織，測(cè)定肺的濕干比。用HYP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肺組織中的HYP濃度。

• ASCP-BCN標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及磁性操作對(duì)PF的治療作用。

• MSC治療博萊霉素誘導(dǎo)的PF小鼠模型的實(shí)驗(yàn)方案。（b-e）小鼠肺功能沒(méi)有治療（控制）和骨髓誘導(dǎo)PF模型小鼠不同治療（鹽水、間充質(zhì)干細(xì)胞，ASCP-BCN標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，和ASCP-BCN標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞+磁操作）后28天第一次注射骨髓：
• 呼吸每分鐘，(c)呼氣流量量50%的肺活量，(d)峰值吸氣流量，和(e)的呼氣流量峰值。

(f)肺內(nèi)HYP的含量。
(g)各組肺的濕干比。
(h)各組肺切片的代表性H&E染色圖像、Masson三色染色圖像、α-SMA免疫組化染色圖像。
(i)通過(guò)H&E染色對(duì)應(yīng)的Ashcroft評(píng)分評(píng)估PF的嚴(yán)重程度。
(j)Masson三色染色測(cè)定肺膠原沉積面積百分比。
(k)免疫組化染色顯示α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。
(l)肺組織中α-SMA和TGF-β的免疫blot分析，(m)相應(yīng)的α-SMA和TGF-β蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
 

• 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)PF的治療作用 

為了評(píng)估ASCP-BCN標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PF治療中的可行性，實(shí)驗(yàn)采用了博萊霉素（BLM）誘導(dǎo)小鼠PF模型。BLM干預(yù)導(dǎo)致小鼠肺功能顯著降低，表現(xiàn)為每分鐘呼吸量（MV）的增加、50%肺活量下的呼氣流量（EF50）、吸氣流量峰值（PIF）和呼氣流量峰值（PEF）的增加。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后可輕微降低上述肺功能參數(shù)，ASCP-BCN標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植和磁吸引進(jìn)一步減輕上述肺功能參數(shù)，說(shuō)明其在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療效果中發(fā)揮重要作用。特別是，ASCP-BCN標(biāo)記的MSCs +磁操作移植組小鼠的呼吸頻率和吸氣流量峰值幾乎達(dá)到了對(duì)照組小鼠。更重要的是，標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞移植和磁操作不僅降低了纖維化肺中的羥脯氨酸（HYP）濃度，而且降低了炎癥引起的肺濕干比。
 
相關(guān)研究成果近期以“Cobalt protoporphyrin-induced nano-self-assembly for CT imaging, magnetic-guidance, and antioxidative protection of stem cells in pulmonary fibrosis treatment”為題發(fā)表在Bioactive Materials（2023,21,129）期刊上。 
相關(guān)鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X22003383 
 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1748013220300669