單細胞轉錄組學揭示特應性皮炎中細胞類型特異性免疫調節(jié)
導語
特應性皮炎( AD )是最常見的慢性炎癥性皮膚病，但對其復雜的發(fā)病機制認識不足，導致治療方案仍然有限。以往對AD的研究都基于皮膚活檢取樣，但活檢是一種局部麻醉的侵入性操作，會造成疼痛并造成一定的創(chuàng)面和瘢痕。本文研究了抽吸起泡，這是一種微創(chuàng)、相對無痛、無疤痕的皮膚取樣技術，在1到2小時內誘導小的充滿液體的水泡。水泡中的液體可用于蛋白質組分析，存在于水泡液中或從水泡頂部(即表皮)分離的細胞可用于流式細胞術分析和單細胞RNA測序(scRNA-seq)，從而可以同時研究可溶性介質和皮膚細胞。
科學問題
本研究對AD患者以及健康人進行抽吸起泡和活檢取樣的樣本進行了單細胞RNA測序，比較了兩種取樣方式的優(yōu)缺點以及捕獲細胞數的異同點，同時分析了健康人和AD患者的細胞圖譜以及基因的差異，為后續(xù)AD的研究奠定了基礎。
研究技術
單細胞RNA測序；Olink蛋白質組學
研究內容
抽吸起泡取樣可捕獲表皮細胞和大多數免疫細胞，除了肥大細胞和非遷移性CD1631巨噬細胞，這些細胞僅存在于活檢樣本中。使用單細胞RNA測序，我們發(fā)現抽吸起泡樣本和活檢AD之間關鍵炎癥通路的轉錄譜具有可比性，但抽吸起泡在高豐度轉錄本(KRT1/KRT10, KRT16/KRT6A, S100A8/S100A9)的細胞特異性分辨率上更強。與健康對照組相比， Th2和Th22細胞中發(fā)現了AD典型細胞因子如IL13和IL22的特征性上調，但也在增殖T細胞和自然殺傷T細胞中發(fā)現了這些介質，它們也表達了抗菌細胞因子IL26�？偟膩碚f，AD中最富集的不是T細胞，而是髓系細胞，同時發(fā)現樹突狀細胞(CLEC7A，雙調節(jié)蛋白AREG, EREG)和巨噬細胞產物(CCL13)是AD皰液蛋白質組學分析中上調最多的蛋白質。
研究思路
研究結果
1. 皮膚細胞的單細胞表達譜
本研究對未經治療的4例AD患者和5例HC健康人的前肘窩處進行抽吸起泡處理，對吸出皰液的上清進行蛋白質組多重分析，并將皰液和酶消化的皰頂(即表皮)的細胞進行混合，用于流式細胞分選（CD45+/CD45-）和scRNA 測序。另外對4例AD患者和2例HC健康樣本的皮膚進行活檢，對活檢后的樣本流式分選（CD45+/CD45-）后進行scRNA-seq，用作對照（圖1A）。對過濾后的抽吸起泡和活檢的細胞，進行聚類以及通過marker基因定義，共鑒定出24（C0-C23）種不同的細胞類型（圖1 B-S）。
圖1
2. 比較抽吸起泡和活檢分離的細胞類型圖譜
通過比較AD皮膚活檢(圖2 A-B)與AD和HC抽吸起泡樣本(圖2 C-F)獲得的細胞，發(fā)現大多數細胞群在3組中都存在。另外活檢組織中鑒定的4個T細胞和5個DC簇也存在于抽吸起泡樣本(圖2C-D)中，而HCs (圖2E-F)中增殖T細胞( Tcell-3 )、DC-1至DC-3和pDC群的頻率較低，與AD的炎癥本質一致，具有較高的免疫細胞數量。
圖2
3. 活檢與抽吸起泡樣本中基因表達的差異
接下來，研究比較了活檢和抽吸起泡樣本的HC組和AD組的差異基因�？傮w而言，無論是HC抽皰和HC活檢，還是AD抽皰和AD活檢，大多數基因在抽皰和活檢樣本中表現出相似的表達（圖3A）。但是結構角蛋白在AD和HC樣本中顯示出相似的表達，而炎癥角蛋白（KRT16/KRT6A）在HC樣本(圖3B-C)中顯示出相當弱的表達，這與在非炎癥環(huán)境中炎癥相關介質的表達一致。在AD慢性病變中經典上調的其他炎癥標志物中，如TH1相關的( IFNG ) (圖3E)、TH2相關的( IL4R、IL5、IL13)(圖3F-H)和TH22相關的標志物( IL22 ) (圖3J)，在AD樣本中的表達強于HC樣本，這與之前的研究一致。相比之下，TH17激活的標記物（IL17A）（圖3I）和CCL20在抽吸起泡AD中明顯低于活檢樣本。總的來說，這些數據表明，在抽皰樣本中可以捕捉到AD典型的TH2 / TH22相關炎癥細胞因子表達情況。
圖3
4. 抽吸起泡樣本中AD與HC差異基因比較
為了進一步揭示抽吸起泡樣本中AD和HC樣本之間的基因表達差異，研究在熱圖中展示了10個上調基因和下調基因。上調的基因包括前面提到的TH亞群相關細胞因子IL13和IL22，它們在T細胞中具有相當異質性的表達(圖4A，橙色框)，也包括CD4和CD8A在亞群中的表達（圖4B,C）。AD在T cell-2中GZMB和NKG7表達增加，在TREG中IL2RA和TNFRSF4表達增加(圖4B-C)。除KC (KC-5, KC-6)外，TCELL-3簇中增殖標志物高表達，AD比HC中表達水平有升高趨勢。AD和HC中的T細胞均為組織常駐記憶標記CD69陽性(圖4D)，如前所述，調節(jié)性T細胞水平最低。在DC和巨噬細胞中，一些炎癥標志物如RNASE1、LYZ和CCL17(圖4A，綠框，E-G)在AD中強烈上調，以及EGFR配體雙調節(jié)蛋白(AREG)(圖4H)，促進KC增殖。除DC外，AD中KCs(圖4A，藍框)和T細胞中AREG也增加。
圖4
5. AD樣本中的T細胞類型
接下來對T細胞進行了亞群聚類并進行了分組間的比較，T細胞被分為了9個亞群，但并不是所有的細胞都表達CD3D（圖5A-B）。其中簇(0、2、3和4)的標記基因分別對應于T cell-1、TREG、T cell-2和T cell-3。其中C1代表靜態(tài)記憶T細胞，C0包含激活的記憶T細胞，其效應功能由促炎細胞因子的活躍產生介導，如TH2和Th22相關的介質IL13和IL22，以及Th17相關的細胞因子IL26(圖5C-E)，盡管IL17表達低到缺失。細胞毒性CD8+T細胞主要存在于表達IFNG(圖5F)和GZMB的C3中。
圖5
6. 蛋白質組學水皰液分析補充了單細胞轉錄組學，揭示了多個DC相關標記物的上調
本研究對8名AD患者和8名HC患者(包括接受scRNA-seq的患者)的皰液進行了蛋白質組學分析，補充了細胞scRNA-seq數據。研究使用炎癥、免疫和神經學panel進行了Olink多重檢測，其中包含368個已建立的探索性生物標志物。圖6A展示了8例AD和8例HC樣本中olink檢測蛋白的歸一化表達，大多數AD樣本表現出一些表達水平的增加，但在樣本之間存在相當大的異質性。在AD和HC樣品中，有42種蛋白存在顯著差異(FDR<0.05)(圖6B)。為了將檢測到的皰液蛋白質分配到特定的細胞類型，繪制了Olink皰液scRNA檢測中與蛋白質豐度差異相對應的基因熱圖。該分析顯示了27個標記物，如圖6C所示，大多數標記物在由DC和巨噬細胞組成的髓系細胞室中發(fā)現。這些基因包括表皮增生介質(AREG, EREG)，病原體模式識別受體(CLEC7A)，細胞因子受體(CSF2RA)，與TH2免疫相關的細胞因子(CCL13)，參與組織重塑和細胞外基質降解的標記(CDH3, PLAU)，以及在成熟DC上特別表達的共刺激分子(CD40, TNFRSF9) (DC-3)。其他類型的細胞僅表現出某些介質的微弱或部分上調，包括黑色素細胞的CXCL1，一些T細胞的TNFSF11，以及一些KCs的IL18和CXADR（圖6D-L）。
圖6
結論
這些數據表明，通過使用scRNA-seq技術，抽吸起泡比傳統(tǒng)活檢具有幾個優(yōu)勢，包括更好的皮膚細胞轉錄組分辨率，結合間質液的蛋白質組學信息，揭示塑造AD細胞和蛋白質組學微環(huán)境的新型炎癥因子。
參考文獻：
Rojahn T B, Vorstandlechner V, Krausgruber T, et al. Single-cell transcriptomics combined with interstitial fluid proteomics defines cell type–specific immune regulation in atopic dermatitis[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2020, 146(5): 1056-1069.
