多重?zé)晒饷庖呓M化實(shí)驗(yàn)相關(guān)技術(shù)問(wèn)答（二）

Q1：為什么每染一個(gè)抗體就要做抗原修復(fù)呢，我可以只在第一個(gè)指標(biāo)做，后面不做嗎？

A1：不可以的，每染完一個(gè)抗體都是需要做抗原修復(fù)的。染第一個(gè)抗體之前做抗原修復(fù)，是為了使被石蠟或者固定劑封閉的抗原決定簇重新暴露出來(lái)，使得抗體能夠識(shí)別到抗原；在染后面每一個(gè)抗體之前的抗原修復(fù)，目的是為了去除掉上一輪染色的抗體和殘留沒(méi)有結(jié)合上的染料，其實(shí)更準(zhǔn)確的叫法是“抗體洗脫”，因?yàn)槲覀冏龆嗌珜?shí)驗(yàn)，沒(méi)有限制一抗的來(lái)源，您的一抗可能都是來(lái)源于兔子，那我們對(duì)應(yīng)每一個(gè)一抗所使用的二抗都是抗兔，如果不洗脫前一個(gè)一抗，染第二個(gè)抗體的時(shí)候，二抗也會(huì)和上一輪的一抗結(jié)合，產(chǎn)生大面積非特異性染色，所以抗體洗脫是整個(gè)多色實(shí)驗(yàn)必不可少的核心步驟。

Q2：抗原修復(fù)液（抗體洗脫液）每一輪修復(fù)都要更換嗎？

A2：需要的，首先我們的抗原修復(fù)液需要根據(jù)下一輪要染的一抗來(lái)選擇，有的一抗需要用檸檬酸修復(fù)，有的又需要EDTA修復(fù)，抗體廠家往往會(huì)注明他們的抗體需要用什么修復(fù)液；其次，就算我們所有的一抗都是推薦用檸檬酸修復(fù)，但每洗脫完一個(gè)指標(biāo)，修復(fù)液中都會(huì)殘留上一個(gè)指標(biāo)的抗體，如果重復(fù)使用修復(fù)液，會(huì)對(duì)后面的指標(biāo)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致非特異性染色。

Q3：我的組織有自發(fā)熒光，我還能做多色嗎？

A3：一般情況下是可以的。首先，您可以用熒光成像設(shè)備直接觀察您白片（不做任何處理的組織切片）的自發(fā)熒光情況，可以每一個(gè)通道都成像試試，看看自發(fā)熒光具體是在哪個(gè)或者哪些通道能夠觀察到；確定了自發(fā)熒光大概的波長(zhǎng)范圍以后，我們?cè)谶x擇多色染料的時(shí)候，要避開(kāi)自發(fā)熒光所在的波長(zhǎng)，比如您的自發(fā)熒光在FITC通道能夠觀察到，在其他通道都沒(méi)有，那對(duì)應(yīng)Absin多色染料有重合的就是TSA520，在染多色的時(shí)候只要不選TSA520即可。當(dāng)然我們?yōu)榱吮荛_(kāi)自發(fā)熒光通道，勢(shì)必要舍棄一些染料，那最后能染的顏色數(shù)量也會(huì)相應(yīng)減少，并且假如您發(fā)現(xiàn)樣本在您儀器的所有熒光通道都能觀察到信號(hào)，那這個(gè)樣本就不適合用來(lái)做多色了，需要重新制備樣本。

Q4：微波修復(fù)，高壓修復(fù)，抗體洗脫液洗脫，這幾種修復(fù)方式做出來(lái)的染色效果差別大嗎？

A4：修復(fù)方式對(duì)染色效果的影響其實(shí)視一抗和樣本來(lái)定。對(duì)于大部分的石蠟樣本，我們推薦用高壓熱修復(fù)，這種修復(fù)方式是公認(rèn)的比較好的修復(fù)方式，Absin實(shí)驗(yàn)室一直采用的也是高壓熱修復(fù)，當(dāng)然微波熱修復(fù)效果也不錯(cuò)，但不同微波爐的性能不同，所以工作條件不能完全復(fù)刻，需要做一些摸索，并且微波熱修復(fù)可能會(huì)持續(xù)比較長(zhǎng)的時(shí)間，容易導(dǎo)致修復(fù)液蒸干影響效果。而抗體洗脫液主要是針對(duì)一些無(wú)法采用熱修復(fù)或者熱修復(fù)容易脫片的樣本（如冰凍切片、硬骨切片等），工作條件更溫和，洗脫效果則取決于切片厚度、洗脫溫度和時(shí)間、一抗種類(lèi)（洗脫難度：結(jié)構(gòu)性膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白 > 胞漿蛋白 > 胞核蛋白）。對(duì)于能夠經(jīng)得起多輪熱修復(fù)的樣本，我們更推薦采用熱修復(fù)。
 

Q5：做多色實(shí)驗(yàn)，除了多色試劑盒以外，我還需要準(zhǔn)備什么材料呢？

A5：我們?cè)噭┖欣锩姘�含TSA熒光染料、染料稀釋液、二抗、DAPI、抗熒光淬滅封片劑，除了這些以外的試劑都是需要您自己準(zhǔn)備的，按照免疫組化的試劑準(zhǔn)備即可。最重要的是您需要配備熒光成像設(shè)備。

Q6：我們實(shí)驗(yàn)室有熒光設(shè)備，但我不知道能否用來(lái)觀察多色？

A6：您需要確認(rèn)您的熒光設(shè)備各個(gè)通道的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)（可以咨詢(xún)儀器廠家），跟我們熒光染料的波長(zhǎng)做匹配（見(jiàn)下表），我們提供的是最佳波長(zhǎng)，在該波長(zhǎng)下能夠得到最好的成像效果，但假如參數(shù)相差30nm，也是可以觀察到的；如果您確實(shí)無(wú)從得知具體的儀器參數(shù)，那也可以做一些近似波長(zhǎng)匹配，比如您知道您的顯微鏡可以觀察FITC，那么對(duì)應(yīng)Absin多色染料近似是TSA520；如果您發(fā)現(xiàn)您儀器的個(gè)別通道也不在我們近似波長(zhǎng)的清單中，比如Texas Red，那您可以查一些資料確認(rèn)一下該染料的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)（Texas Red EX/EM：570/600nm），再去對(duì)應(yīng)Absin的染料參數(shù)，跟TSA620（EX/EM：590/620nm）比較近，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)都在30nm范圍內(nèi)，那么判斷該通道是可以觀察TSA620這個(gè)染料的。但染料近似匹配還是有可能存在觀察不了的情況，確認(rèn)儀器參數(shù)是最精準(zhǔn)的，如果最后發(fā)現(xiàn)染完色確實(shí)成像不了，也可以咨詢(xún)Absin掃片服務(wù)哦。