噬菌體展示文庫構建全流程
1.什么是噬菌體展示
噬菌體文庫是用于基因克隆的噬菌體載體，噬菌體展示文庫是將外源蛋白或多肽與噬菌體外殼蛋白融合，展示在噬菌體表面并保持特定的空間構象，利用特異性親和作用以篩選特異性蛋白或多肽的一項新技術。
2.噬菌體文庫類型
卡梅德生物在抗體領域研究多年，我們構建的噬菌體展示技術服務涵蓋了多種文庫類型，包涵羊駝/駱駝VHH抗體庫，人源噬菌體文庫，人源SscFV抗體庫，人源Fab抗體文庫，噬菌體肽庫，預制肽文庫等多種優(yōu)質的抗體庫，可根據客戶的需求提供定制服務，并提供靈活有效的篩選服務。
3.噬菌體文庫篩選應用
噬菌體展示文庫技術是一種新興的生物技術，利用噬菌體展示技術獲得的外源蛋白保持獨立的空間結構和生物活性，目前在新型疫苗的研制，酶抑制劑的篩選，醫(yī)學診斷和治療，多肽藥物的開發(fā)，抗原表位分析，單抗篩選，蛋白相互作用的研究等領域得到了廣泛的應用，并顯示了良好的應用前景。
4.噬菌體文庫構建的技術優(yōu)勢
（1）篩選容量大、可發(fā)酵大量生產、方法簡單，目前我們獲得的噬菌體一級免疫文庫的庫容可達108-109，其序列豐度>99%，保證直接篩選獲得的抗體親和力達到nM甚至pM級別。
（2）將基因型與表型、分子結合活性與噬菌體的可擴增性結合在一起，是一種篩選新技術。
（3）快速制備可溶抗原，結合公司現有的重組蛋白表達體系，能夠在短時間內制備出高純度、高生物學活性的可溶抗原蛋白，用以支持噬菌體抗體的免疫及篩選工作。
5.卡梅德生物能夠為客戶提供高質量的噬菌體文庫構建服務
M13單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)是目前應用較廣泛的文庫展示系統(tǒng)，通過將蛋白、抗體或多肽與噬菌體pIII蛋白融合表達，使之參與噬菌體組裝，并展示在噬菌體表面，形成噬菌體展示文庫，卡梅德生物利用M13絲狀噬菌體殼蛋白pIII和PVIII展示技術，能夠為客戶構建不同物種的天然或者免疫的噬菌體抗體展示文庫，通過抗體庫技術制備多物種單克隆抗體，如人，鼠，兔，雞，羊，鵝，豬，牛，馬，驢，駱駝，羊駝，鯊魚等物種來源的單克隆抗體，可根據客戶的需求提供定制服務，并且?guī)烊萘靠蛇_1011。
6.卡梅德生物為客戶提供噬菌體文庫構建服務的全流程介紹
卡梅德生物為客戶提供噬菌體文庫構建服務，流程包括：總RNA提取，反轉錄獲取cDNA，PCR擴增，載體與 PCR 產物酶切連接，細菌文庫構建，噬菌體文庫構建，噬菌體文庫效價檢測。
6.1總RNA提取
將外周血淋巴細胞從冰箱取出后分裝，加入氯仿，離心后取上清加入異丙醇，離心保留沉淀，加入75%乙醇后離心保留沉淀，干燥后加入DEPC水，孵育確保RNA溶解，將各管混合到一管中即為總RNA，取1μl總RNA進行電泳，取2μl用核酸濃度測量儀測濃度。
6.2反轉錄獲取cDNA
按照商業(yè)化試劑盒操作說明書進行cDNA制備，將上一步得到的RNA一分為二反轉錄成cDNA，反轉錄引物分別用Oligo dTprimer及random 6-mers。
6.3PCR擴增
6.3.1第一輪PCR
以 cDNA 為模板進行第一輪PCR反應，使用HS Ex Taq酶進行PCR擴增。PCR反應體系為：
將得到的PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，找到目的條帶進行上述條件PCR擴增，將所有PCR產區(qū)進行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用通用型DNA純化回收試劑盒對切膠的膠條進行DNA回收。
6.3.2 第二輪PCR
以上一步PCR擴增并回收后的DNA片段作為模板再次擴增特定的抗體片段，PCR 反應體系為：
將得到的PCR擴增產物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收。
6.4載體與PCR產物酶切連接
第二輪PCR產物通過酶切連接到噬菌體質粒pADL-10b中，從而構建含有擴增片段的噬菌體質粒庫。將連接產物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收，分別取2μl用核酸濃度測量儀檢測回收產物的濃度。
6.5細菌文庫構建
將連接產物進行電擊轉化后構建含有目的抗體片段的大腸桿菌文庫。
取SS320大腸桿菌感受態(tài)細胞，加入回收后的連接產物，將混合后的感受態(tài)細胞和連接產物轉移到預冷好的電轉杯中，使用電轉儀預設的轉化程序電擊轉化，電轉后立即往電轉杯中加入950μlSOC培養(yǎng)基，至少進行20個電轉。將細胞復蘇后涂在含有氨芐抗性的瓊脂糖培養(yǎng)板上過夜生長。將上一步過夜生長后的培養(yǎng)板上的細胞用2xYT培養(yǎng)基和涂布棒沖洗刮下，加入20%的甘油測OD600nm值后保存在-80℃，即為細菌文庫。
6.6噬菌體文庫構建
6.6.1噬菌體文庫擴增
將上一步刮下的菌體混勻后轉移到100 mL預先加入四環(huán)素的2x YT培養(yǎng)液中，37℃，250rpm培養(yǎng)直至OD600nm達到0.5-0.55。
按照輔助噬菌體：細菌細胞數目為20:1的比例加入輔助噬菌體后繼續(xù)37℃培養(yǎng)30分鐘。加入終濃度為50µg/mL的Kana和終濃度為0.2mMI PTG，30℃過夜搖床培養(yǎng)。
6.6.2噬菌體文庫制備
將過夜培養(yǎng)的細菌4℃ 4000 rpm離心20分鐘，將上清轉移到新的離心管后加入1/4體積預冷的的20％PEG/2.5M NaCl，在冰上孵育30分鐘。4℃ 4000 rpm離心20分鐘去除上清后加入1 mL PBS緩沖液溶解沉淀。再次加入1/4 體積預冷的20％PEG/2.5M NaCl后冰上孵育10分鐘，4℃ 12000 xg離心10分鐘后去除上清并將沉淀溶解在1 mL PBS中得到噬菌體庫，長期-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存。
6.7噬菌體文庫效價檢測
將-80℃冰箱保存的 SS320 菌株培養(yǎng)后，從單菌落板上挑取一個單菌落到 5ml 2×YT 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)菌液OD600 為 0.5-0.55。取制備好的噬菌體文庫稀釋12個梯度，每個梯度加入90μl 的 SS320 菌液培養(yǎng)，每個稀釋管取5μl加到2×YT 固體培養(yǎng)基（Amp）過夜培養(yǎng)，即可計算效價。
噬菌體文庫是用于基因克隆的噬菌體載體，噬菌體展示文庫是將外源蛋白或多肽與噬菌體外殼蛋白融合，展示在噬菌體表面并保持特定的空間構象，利用特異性親和作用以篩選特異性蛋白或多肽的一項新技術。
卡梅德生物在抗體領域研究多年，我們構建的噬菌體展示技術服務涵蓋了多種文庫類型，包涵羊駝/駱駝VHH抗體庫，人源噬菌體文庫，人源SscFV抗體庫，人源Fab抗體文庫，噬菌體肽庫，預制肽文庫等多種優(yōu)質的抗體庫，可根據客戶的需求提供定制服務，并提供靈活有效的篩選服務。
3.噬菌體文庫篩選應用
噬菌體展示文庫技術是一種新興的生物技術，利用噬菌體展示技術獲得的外源蛋白保持獨立的空間結構和生物活性，目前在新型疫苗的研制，酶抑制劑的篩選，醫(yī)學診斷和治療，多肽藥物的開發(fā)，抗原表位分析，單抗篩選，蛋白相互作用的研究等領域得到了廣泛的應用，并顯示了良好的應用前景。
4.噬菌體文庫構建的技術優(yōu)勢
（1）篩選容量大、可發(fā)酵大量生產、方法簡單，目前我們獲得的噬菌體一級免疫文庫的庫容可達108-109，其序列豐度>99%，保證直接篩選獲得的抗體親和力達到nM甚至pM級別。
（2）將基因型與表型、分子結合活性與噬菌體的可擴增性結合在一起，是一種篩選新技術。
（3）快速制備可溶抗原，結合公司現有的重組蛋白表達體系，能夠在短時間內制備出高純度、高生物學活性的可溶抗原蛋白，用以支持噬菌體抗體的免疫及篩選工作。
5.卡梅德生物能夠為客戶提供高質量的噬菌體文庫構建服務
M13單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)是目前應用較廣泛的文庫展示系統(tǒng)，通過將蛋白、抗體或多肽與噬菌體pIII蛋白融合表達，使之參與噬菌體組裝，并展示在噬菌體表面，形成噬菌體展示文庫，卡梅德生物利用M13絲狀噬菌體殼蛋白pIII和PVIII展示技術，能夠為客戶構建不同物種的天然或者免疫的噬菌體抗體展示文庫，通過抗體庫技術制備多物種單克隆抗體，如人，鼠，兔，雞，羊，鵝，豬，牛，馬，驢，駱駝，羊駝，鯊魚等物種來源的單克隆抗體，可根據客戶的需求提供定制服務，并且?guī)烊萘靠蛇_1011。
6.卡梅德生物為客戶提供噬菌體文庫構建服務的全流程介紹
卡梅德生物為客戶提供噬菌體文庫構建服務，流程包括：總RNA提取，反轉錄獲取cDNA，PCR擴增，載體與 PCR 產物酶切連接，細菌文庫構建，噬菌體文庫構建，噬菌體文庫效價檢測。
將外周血淋巴細胞從冰箱取出后分裝，加入氯仿，離心后取上清加入異丙醇，離心保留沉淀，加入75%乙醇后離心保留沉淀，干燥后加入DEPC水，孵育確保RNA溶解，將各管混合到一管中即為總RNA，取1μl總RNA進行電泳，取2μl用核酸濃度測量儀測濃度。
6.2反轉錄獲取cDNA
按照商業(yè)化試劑盒操作說明書進行cDNA制備，將上一步得到的RNA一分為二反轉錄成cDNA，反轉錄引物分別用Oligo dTprimer及random 6-mers。
6.3PCR擴增
6.3.1第一輪PCR
以 cDNA 為模板進行第一輪PCR反應，使用HS Ex Taq酶進行PCR擴增。PCR反應體系為：
| 試劑 | 使用量 |
| cDNA | 0.5-5μl |
| AlpVh-L/CALL 002 | 2μl/2μl |
| dNTP Mix | 4μl |
| 10×ExTaq Buffer | 5μl |
| HS Ex Taq | 0.25μl |
| ddH2O | Up to 50μl |
將得到的PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，找到目的條帶進行上述條件PCR擴增，將所有PCR產區(qū)進行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用通用型DNA純化回收試劑盒對切膠的膠條進行DNA回收。
6.3.2 第二輪PCR
以上一步PCR擴增并回收后的DNA片段作為模板再次擴增特定的抗體片段，PCR 反應體系為：
| 試劑 | 使用量 |
| 第一輪 PCR 回收產物 | 0.1-2μl |
| Rvhh FP/RvhhRP | 2μl/2μl |
| dNTP Mix | 4μl |
| 10×ExTaq Buffer | 5μl |
| HS Ex Taq | 0.25μl |
| ddH2O | Up to 50μl |
將得到的PCR擴增產物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收。
第二輪PCR產物通過酶切連接到噬菌體質粒pADL-10b中，從而構建含有擴增片段的噬菌體質粒庫。將連接產物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收，分別取2μl用核酸濃度測量儀檢測回收產物的濃度。
6.5細菌文庫構建
將連接產物進行電擊轉化后構建含有目的抗體片段的大腸桿菌文庫。
取SS320大腸桿菌感受態(tài)細胞，加入回收后的連接產物，將混合后的感受態(tài)細胞和連接產物轉移到預冷好的電轉杯中，使用電轉儀預設的轉化程序電擊轉化，電轉后立即往電轉杯中加入950μlSOC培養(yǎng)基，至少進行20個電轉。將細胞復蘇后涂在含有氨芐抗性的瓊脂糖培養(yǎng)板上過夜生長。將上一步過夜生長后的培養(yǎng)板上的細胞用2xYT培養(yǎng)基和涂布棒沖洗刮下，加入20%的甘油測OD600nm值后保存在-80℃，即為細菌文庫。
6.6.1噬菌體文庫擴增
將上一步刮下的菌體混勻后轉移到100 mL預先加入四環(huán)素的2x YT培養(yǎng)液中，37℃，250rpm培養(yǎng)直至OD600nm達到0.5-0.55。
按照輔助噬菌體：細菌細胞數目為20:1的比例加入輔助噬菌體后繼續(xù)37℃培養(yǎng)30分鐘。加入終濃度為50µg/mL的Kana和終濃度為0.2mMI PTG，30℃過夜搖床培養(yǎng)。
6.6.2噬菌體文庫制備
將過夜培養(yǎng)的細菌4℃ 4000 rpm離心20分鐘，將上清轉移到新的離心管后加入1/4體積預冷的的20％PEG/2.5M NaCl，在冰上孵育30分鐘。4℃ 4000 rpm離心20分鐘去除上清后加入1 mL PBS緩沖液溶解沉淀。再次加入1/4 體積預冷的20％PEG/2.5M NaCl后冰上孵育10分鐘，4℃ 12000 xg離心10分鐘后去除上清并將沉淀溶解在1 mL PBS中得到噬菌體庫，長期-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存。
6.7噬菌體文庫效價檢測
將-80℃冰箱保存的 SS320 菌株培養(yǎng)后，從單菌落板上挑取一個單菌落到 5ml 2×YT 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)菌液OD600 為 0.5-0.55。取制備好的噬菌體文庫稀釋12個梯度，每個梯度加入90μl 的 SS320 菌液培養(yǎng)，每個稀釋管取5μl加到2×YT 固體培養(yǎng)基（Amp）過夜培養(yǎng)，即可計算效價。
