3D培養(yǎng)體系在食蟹猴培養(yǎng)揭示靈長類早期器官發(fā)生調(diào)控機(jī)制的應(yīng)用

近年來我國育齡夫婦的流產(chǎn)及出生缺陷發(fā)生率已分別接近10%及5.6%，病人數(shù)量巨大，嚴(yán)重影響出生人口質(zhì)量，生殖健康形勢(shì)嚴(yán)峻，降低流產(chǎn)及出生缺陷發(fā)生率已成為我國人口健康大戰(zhàn)略重要目標(biāo)之一。解析早期胚胎發(fā)育事件及其調(diào)控機(jī)制有助于我們深入理解早期胚胎和器官發(fā)育與疾病發(fā)生的關(guān)系，為孕早期流產(chǎn)和出生缺陷防治及發(fā)育源性疾病的診治提供理論基礎(chǔ)和新的途徑，這也是當(dāng)前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的難點(diǎn)與熱點(diǎn)之一。但人們對(duì)這一時(shí)期人胚胎發(fā)育，特別是早期著床后胚胎發(fā)育知之甚少，處于“黑匣子”狀態(tài)，對(duì)早期胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制的深入理解，亟待創(chuàng)新性研究體系的建立與理論和技術(shù)突破。

|結(jié)|果

　　2023年5月11日，省部共建非人靈長類生物醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/昆明理工大學(xué)靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院譚韜/陳永昌/季維智團(tuán)隊(duì)、中國人民解放軍總醫(yī)院/血液與健康全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉兵團(tuán)隊(duì)及德州西南醫(yī)學(xué)中心吳軍團(tuán)隊(duì)合作在Cell期刊發(fā)表題為 Ex utero monkey embryogenesis from blastocyst to early organogenesis 的研究論文。該研究開發(fā)了一種3D培養(yǎng)系統(tǒng)（EMEUC），實(shí)現(xiàn)了食蟹猴胚胎體外25天（25 d.p.f.）的長時(shí)程培養(yǎng)（圖一）。利用該平臺(tái)，研究人員系統(tǒng)研究了原腸運(yùn)動(dòng)及造血等早期組織器官發(fā)生的的譜系特化軌跡和分子演進(jìn)規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制。

　　研究者首先優(yōu)化了前期食蟹猴胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)（專家點(diǎn)評(píng)丨中國學(xué)者Science背靠背揭示體外培養(yǎng)的靈長類動(dòng)物早期胚胎發(fā)育圖譜），借助細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建了3D培養(yǎng)環(huán)境，同時(shí)借助葡萄糖的加入，促進(jìn)了胚胎體外發(fā)育，培養(yǎng)胚胎在形態(tài)、發(fā)育進(jìn)程等與體內(nèi)胚胎高度一致，大約對(duì)應(yīng)體內(nèi)的卡內(nèi)基階段8c時(shí)期。結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（scRNA-seq）和免疫熒光染色驗(yàn)證，研究人員發(fā)現(xiàn)EMEUC培養(yǎng)的胚胎除了早期神經(jīng)分化，還出現(xiàn)了造血譜系特化，其高度模擬了體內(nèi)卵黃囊的兩個(gè)波次造血發(fā)生，尤其是捕獲并識(shí)別了猴第一波次造血的關(guān)鍵前體細(xì)胞（包括生血成血管細(xì)胞（Hemogenic angioblast）、第一波次造血祖細(xì)胞），這也是迄今為止它們?cè)诜侨遂`長類胚胎中被首次精確識(shí)別和系統(tǒng)解析，而在以往的人多能干細(xì)胞體外分化體系中并不能很好的重現(xiàn)。此外，與人多能干細(xì)胞的體外分化體系相比，體外培養(yǎng)的猴胚能夠產(chǎn)生更接近人體內(nèi)第二波次造血的生血內(nèi)皮細(xì)胞，這些結(jié)果表明該體系有望成為更合適的靈長類早期造血的研究模型。接下來，研究團(tuán)隊(duì)通過人、猴、鼠跨物種的整合分析發(fā)現(xiàn)，猴的第二波次造血與人更為接近，表明人、猴在早期造血發(fā)育具有較強(qiáng)的保守性而與嚙齒類存在差異。最后，該研究還進(jìn)一步聚焦猴第一波次造血特化的過程，并系統(tǒng)揭示了猴和小鼠在該過程中的物種保守和差異的分子事件（圖二）。

圖二 體外培養(yǎng)食蟹猴胚胎早期造血發(fā)生。A.主要的卵黃囊內(nèi)皮及兩個(gè)波次造血細(xì)胞群體；B.不同的細(xì)胞群體的時(shí)間動(dòng)力學(xué)變化；C.人、猴、鼠胚胎早期主要內(nèi)皮造血相關(guān)群體的相關(guān)性分析.

　　除了外胚層和中胚層的譜系特化外，研究人員還觀察到內(nèi)胚層的特化，在體外培養(yǎng)猴胚胎中發(fā)現(xiàn)了早期腸（primitive gut）的形成, 并與體內(nèi)猴胚胎及人胚胎腸亞群高度一致；進(jìn)一步研究表明，BMP和EGF信號(hào)通路與前腸形成有關(guān)，而WNT和Hedgehog信號(hào)通路可能在后腸發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并提出內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞參與了前、后腸發(fā)育過程。前期研究表明，體外培養(yǎng)猴胚胎可以形成原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（PGCLC），PGCLC細(xì)胞是否可以在體外發(fā)生遷移并進(jìn)一步成熟，尚不了解。研究者們借助EMEUC系統(tǒng)，揭示隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，PGCLC細(xì)胞開始向卵黃囊遷移，隨之代謝模式從糖酵解向氧化磷酸化轉(zhuǎn)變。最后，作者系統(tǒng)揭示了食蟹猴早期胚胎發(fā)育中的X染色體劑量補(bǔ)償調(diào)控過程，值得指出的是雌性PGCLC中X染色體總體基因表達(dá)水平逐漸上調(diào)，且存在X染色體再激活過程。參與X染色體失活的長鏈非編碼RNA（lncRNA）XIST在雄性早期PGCLCs中很少或沒有表達(dá)，晚期升高，而在雌性PGCLC中表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定。

 

|總|結(jié)

　　綜上，研究者們開發(fā)了一種能夠支持食蟹猴胚胎體外發(fā)育至早期器官發(fā)生的3D培養(yǎng)體系，并系統(tǒng)研究了非人靈長類從原腸胚形成到早期器官發(fā)生過程的重要細(xì)胞組成及譜系分化軌跡，研究結(jié)果將有助于了解人類胚胎發(fā)育畸形孕早期流產(chǎn)。

 

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