DNA提取實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞裂解和DNA提取純化的幾種方法介紹

脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）是核酸的一種，是所有生物的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。生物體親子之間的相似性和繼承性即所謂的遺傳信息，都貯存在DNA分子中。核酸的提取是任何分子生物學(xué)研究的起點(diǎn)，因此被認(rèn)為是一個(gè)至關(guān)重要的過(guò)程。自1869年弗里德里希·米歇爾首次進(jìn)行DNA提取以來(lái)，科學(xué)家們?cè)谠O(shè)計(jì)更可靠、更容易、更快速、更經(jīng)濟(jì)、產(chǎn)量更高的提取方法方面取得了非凡的進(jìn)步，因此也拓展出了各種原理不同的DNA提取方法。本期小愛(ài)給大家?guī)��?lái)的就是DNA的不同提取方法介紹。
 

DNA的質(zhì)量是進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，DNA提取的原則主要是：保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性和純度，應(yīng)滿足以下幾點(diǎn)：

DNA的提取過(guò)程可以簡(jiǎn)單的分為細(xì)胞裂解和DNA提取純化兩大步驟，裂解是破壞樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而使樣品中的DNA游離在裂解體系中的過(guò)程，提取純化則是使DNA與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過(guò)程。
 

一 、細(xì)胞裂解方法

對(duì)于基因組DNA提取，細(xì)胞裂解的方法主要有物理機(jī)械法和化學(xué)法。

表1 基因組DNA裂解方法

以上幾種細(xì)胞破碎方法均可相互結(jié)合使用，使細(xì)胞破碎完全、讓核酸復(fù)合物暴露出來(lái)，有利于接下來(lái)的核酸提取與純化步驟。目前市面上裂解液中都含有去垢劑（如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20等）、鹽溶液（如Tris、EDTA、NaCl等），有的也可能會(huì)加入蛋白酶。去垢劑的主要作用是：使蛋白質(zhì)變性；破壞膜結(jié)構(gòu)；去除與核酸相互作用的蛋白質(zhì)。鹽溶液的作用主要是提供合適的裂解環(huán)境，如Tris、抑制核酸酶對(duì)核酸的降解，如EDTA、維持核酸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，如NaCl。蛋白酶的作用是利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)DNA與蛋白質(zhì)的分離，同時(shí)，也便于后續(xù)的純化操作。簡(jiǎn)單介紹主流的細(xì)胞裂解方法：
 

SDS法（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去垢劑，高溫（55-60℃）裂解細(xì)胞，使蛋白變性，染色體離析，在高鹽環(huán)境下或降低溫度后蛋白、多糖等結(jié)合形成的復(fù)合物沉淀，釋放核酸。適用于動(dòng)物組織、細(xì)胞、血液DNA的裂解提取。
 

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽(yáng)離子去垢劑，可以溶解細(xì)胞膜，與核酸結(jié)合形成在高鹽環(huán)境下可溶的復(fù)合物。此類方法特別適合裂解植物樣本進(jìn)行DNA的提取。
 

二 、DNA提取純化方法
 

沉淀法是比較經(jīng)典的核酸提取純化方法，主要有兩種：苯酚/氯仿有機(jī)溶劑萃取法和鹽析沉淀法。苯酚/氯仿有機(jī)溶劑萃取法主要先利用酚氯仿對(duì)裂解體系進(jìn)行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)DNA與蛋白質(zhì)的分離，再用醇將DNA沉淀下來(lái)，實(shí)現(xiàn)核酸與鹽的分離。此種方法操作時(shí)間較長(zhǎng)，且有機(jī)溶劑對(duì)人體有害。鹽析沉淀法是苯酚/氯仿萃取法的第二代改良方法，原理兩者基本相同，但鹽析沉淀法操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)成本低，生物安全性更高。

離心柱法主要采用特殊硅基質(zhì)吸附材料，利用基因組DNA在高鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜,再通過(guò)一系列快速的漂洗、離心等步驟去除細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì),最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫，通常能在幾分鐘之內(nèi)即可高效回收核酸片段。因離心柱法獲得DNA的純度高、產(chǎn)量高，而且能進(jìn)行微量操作，被廣大科研工作者所接受。

圖2 離心柱法提取DNA操作流程

磁珠法主要是利用DNA在磁珠反應(yīng)體系中會(huì)由線性壓縮成球狀，暴露出核酸骨架上大量的負(fù)電基團(tuán)與反應(yīng)體系中的陽(yáng)離子連接，在磁珠最外層負(fù)電基團(tuán)的作用下，形成“陰離子-陽(yáng)離子-陰離子”的鹽橋結(jié)構(gòu)，使DNA分子被特異性地吸附到磁珠表面。而當(dāng)反應(yīng)緩沖液被棄除后，加入水性分子，會(huì)快速充分水化DNA分子，解除三者之間的離子相互作用，使吸附到磁珠上的DNA被純化出來(lái)。
 

圖2 磁珠提取純化DNA原理

表2 不同DNA提取純化方法對(duì)比