塑料中的毒素鄰苯二甲酸酯（DEHP）對心臟抑制作用的研究
鄰苯二甲酸酯類塑化劑廣泛用于消費品和醫(yī)療產(chǎn)品制造中，包括氣管插管、靜脈輸液袋、血液儲存袋和醫(yī)療管道等。其中，Di(2-ethylhexyl) phthalate （DEHP）常被用作塑化劑添加劑，在聚氯乙烯制品中發(fā)揮軟化和增加柔韌性的作用。由于DEHP與聚氯乙烯之間沒有形成共價結(jié)合，在與親脂溶液接觸、溫度升高或時間延長時，DEHP很容易被溶出。在過去的血庫研究中，溶出的DEHP可以減少紅細胞溶血并延長保存時間，對血液制品有益。然而，新的研究表明DEHP積累在儲存的血液制品中，當無意中接觸時，可能會對人體健康造成危害。
流行病學研究顯示鄰苯二甲酸酯類化學物滲出與心血管疾病死亡風險增加有關(guān)。在本實驗研究中，我們旨在進一步了解臨床鄰苯二甲酸酯滲出對心臟的潛在風險。因此，我們首先測量了存儲紅細胞制品中的DEHP濃度，并將這些濃度作為心臟毒性評估的指導。我們在離體心臟和人誘導多能干細胞衍生心肌細胞中給予DEHP，評估和量化DEHP對心臟電生理指標影響。此外，我們還研究了使用毒蕈堿受體拮抗劑和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑是否能消除DEHP的心臟毒性效應(yīng)。
文中采用MappingLab公司的多通道電極陣列分別貼在左右心房（測量心房傳導）、左心房左心室（測量房室傳導），使用EMapRecord軟件采集電信號，EMapScope進行分析，研究急性給予DEHP后對心臟電生理的直接影響。
結(jié)果：
1、DEHP具有負變時性效應(yīng)，且呈劑量依賴性
DEHP可能會從醫(yī)用塑料中滲出，導致患者無意中接觸到高濃度的DEHP。實驗結(jié)果顯示，在冷藏血液存儲過程中，RBC單位中的DEHP濃度逐漸增加，儲存7天的濃度為23-34 μg/mL，35-42天的濃度增加到42-119 μg/mL（p<0.05；圖1）。以這些濃度為指導，在Langendorff心臟進行量效研究，以評估DEHP對心臟功能的影響。結(jié)果顯示，當DEHP濃度達到一定水平時，抑制心臟自律性，心率下降；高濃度的DEHP引起心臟節(jié)律的異常變化。（圖2A）
文中還對竇房結(jié)恢復(fù)時間（SNRT）進行測量，作為自律性的指標。在control條件下，SNRT保持穩(wěn)定，急性給低劑量DEHP時也保持穩(wěn)定。然而，給予高劑量DEHP后，SNRT明顯延長，表明竇房結(jié)功能受損。部分實驗中無法確定SNRT，因為心房起搏未引發(fā)心室反應(yīng)或竇性活動完全消失。這些結(jié)果揭示了DEHP對竇房結(jié)功能的直接影響。（圖2B）
圖2：DEHP以劑量依賴的方式減慢竇性心率和恢復(fù)時間。
長時間接觸DEHP會對心臟電生理產(chǎn)生明顯影響。研究表明，隨著給予DEHP時間的延長，竇性頻率和心室率逐漸下降，出現(xiàn)房室分離現(xiàn)象。同時心室節(jié)律，心率變異性顯著增加，竇房結(jié)恢復(fù)時間延遲。部分實驗中無法測量到竇房結(jié)恢復(fù)時間，因為心房起搏未能引發(fā)心室反應(yīng)或者竇性活動未能恢復(fù)。此外，還發(fā)現(xiàn)冠狀動脈血流明顯下降。（圖3）
圖3：DEHP以時間依賴的方式減慢竇性心率和恢復(fù)時間。
給予DEHP會延遲心臟傳導速度，導致心房間和心房心室間的傳導時間延長。使用多通道電極陣列（MEA）和光學標測技術(shù)進行測量，發(fā)現(xiàn)DEHP使心房激活時間延長三倍，房室傳導時間延長兩倍。這些結(jié)果表明DEHP對心臟電傳導產(chǎn)生了明顯影響，使心臟傳導速度變慢。（圖4）
圖4：給予DEHP會延遲心房間和房室間的傳導。
在心電圖記錄中，給予DEHP后會導致竇性節(jié)律下的房室傳導減慢。隨著給予DEHP時間的延長，PR間期增加。隨著時間越長，房室傳導延遲可能發(fā)展為房室分離或傳導阻滯。給予電刺激進一步研究DEHP對房室結(jié)功能的影響，在右心房起搏，逐漸增加刺激頻率，發(fā)現(xiàn)加入DEHP后，較慢起搏頻率下更容易導致房室傳導阻滯，且Wenckebach cycle length（WBCL）延長。此外，加入DEHP還導致2：1房室傳導阻滯的發(fā)生頻率增加。另外，在加入DEHP后房室結(jié)有效不應(yīng)期（AVNERP）延長，且需要更長的刺激間期才能誘發(fā)出心室電活動。（圖5）
圖5：給予DEHP會增加房室傳導時間和不應(yīng)期。
4、給予DEHP會減慢心外膜傳導速度，延長動作電位持續(xù)時間
之前曾報道DEHP會破壞細胞間的縫隙連接，細胞間縫隙連接的減少可以降低房室傳導速度和心外膜傳導速度。使用電壓敏感染料和高速光學標測，我們觀察到，給予DEHP會導致心外膜傳導速度減慢，心室動作電位時程（APD）在30%和80%復(fù)極階段均延長。此外，DEHP還延長了心室的有效不應(yīng)期，但對細胞內(nèi)鈣瞬變30%或80%沒有顯著影響。（圖6）
圖6：給予DEHP會減慢心外膜傳導速度并延長動作電位時程。
5、DEHP對心臟電生理的影響不會被毒蕈堿拮抗所消除
先前的研究表明心臟毒蕈堿受體是鄰苯二甲酸酯增塑劑的潛在靶點，因為阿托品可以減弱金魚和人心房肌中鄰苯二甲酸酯的心臟抑制作用。實驗結(jié)果表明，即使在使用阿托品處理的情況下，DEHP對竇性活動和房室傳導的影響依然存在。因此，DEHP的作用不能完全通過毒蕈堿受體拮抗來解釋（圖7）。先前的研究還表明DEHP可以破壞細胞間偶聯(lián)，并且這種影響可能與基質(zhì)金屬蛋白酶活性的上調(diào)有關(guān)，該酶調(diào)節(jié)縫隙連接蛋白并影響心臟的電特性。我們使用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑doxycycline對心臟進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)doxycycline可以部分減輕DEHP對竇性活動的抑制作用，但對房室傳導的影響沒有改善。
圖7：DEHP的作用在一定程度上被基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑緩解，但不受毒蕈堿拮抗作用的影響。
6、DEHP在hiPSC-CM單層細胞中減慢傳導速度
DEHP已被證明能減少細胞間的縫隙連接，但在某些組織(如肝臟)，這種作用可能是特異性的。為了測試在人心肌細胞上的適用性，我們使用人誘導多能干細胞分化的單層心肌細胞（hiPSC-CM），在微電極陣列上進行了傳導速度的測量（以1.5 Hz的頻率進行刺激）。結(jié)果顯示，給予DEHP會以劑量和時間依賴的方式減慢細胞的傳導速度。在最初的15分鐘內(nèi)，較低劑量的DEHP對傳導速度沒有顯著影響，而較高劑量的DEHP會導致傳導速度下降。隨著持續(xù)3小時的DEHP處理，細胞的傳導速度進一步降低。雖然加入阿托品或doxycycline在最初1小時內(nèi)可以減輕DEHP對傳導速度的影響，但在較長時間的DEHP處理后，細胞的傳導速度仍然減慢。（圖8）
圖8：DEHP減慢了hiPSC-CM單層細胞的傳導速度。
討論：
本研究表明，DEHP是一種心臟毒性化學物質(zhì)，以劑量和時間依賴的方式減慢竇性心率，延遲竇房結(jié)恢復(fù)時間，并延長房室傳導時間，影響心臟功能。DEHP作為醫(yī)療塑料增塑劑被長期使用，但是它的使用是存在安全問題的，特別是在輸血和醫(yī)療過程中，減少含DEHP塑料使用漸漸被人們所關(guān)注。本文量化DEHP在血液中的濃度，為無DEHP材料開發(fā)提供指導意見。
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