單細(xì)胞測序鑒定復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤患者的耐藥途徑和治療靶點

期刊：Nature medicine
影響因子：82.9

導(dǎo)語
多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種腫瘤性漿細(xì)胞病變，是惡性漿細(xì)胞的克隆性增殖擁有的屬性。盡管已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，但耐藥患者內(nèi)部和之間的疾病異質(zhì)性特征不明顯。在本研究中，進(jìn)行單臂臨床試驗(nct04065789) ，結(jié)合單細(xì)胞縱向 RNA測序(scRNA-seq)來研究 MM 耐藥機(jī)制的分子動力學(xué)。新診斷的 MM 患者(41例) ，在使用含硼替佐米的方案后無效或經(jīng)歷了早期復(fù)發(fā)，被納入研究對象，評估達(dá)拉圖姆單抗、卡非利布、來那度胺和地塞米松聯(lián)合使用的安全性和有效性。通過對41例原發(fā)性難治和早期復(fù)發(fā)患者(11例健康者和15例初診 MM 患者)的數(shù)據(jù)分析，揭示了新的 MM 分子耐受途徑，包括耐缺氧、蛋白質(zhì)折疊和線粒體呼吸，這些途徑在臨床上具有廣泛的代表性。作者發(fā)現(xiàn)肽基脯氨酰異構(gòu)酶(PPIA)是蛋白質(zhì)折疊反應(yīng)途徑中的一個中心酶，是抗性 MM 的一個潛在的新靶點。Crispr-cas9缺失或應(yīng)用小分子抑制劑(環(huán)孢素)抑制 PPIA 能顯著增強(qiáng) MM 腫瘤細(xì)胞對蛋白酶體抑制劑的敏感性�？傊�，該研究為臨床試驗整合 scRNA-seq 制定了路線圖，確定了高耐藥 MM 患者的特征，并發(fā)現(xiàn) PPIA 是這些腫瘤的有效治療靶點。

研究技術(shù)
單細(xì)胞RNA-seq（MARS-seq）

研究路線

研究結(jié)果
1. NDMM和PRMM患者的轉(zhuǎn)錄組特征比較分析
通過對受試者骨髓中的漿細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，質(zhì)控后剩余51,297個細(xì)胞。作者將這些細(xì)胞劃分成不同狀態(tài)的細(xì)胞亞群，其中包括健康的漿細(xì)胞、NDMM患者以及治療前和治療后的PRMM患者（圖2a）。漿細(xì)胞的標(biāo)記基因如XBP1、MZB1、SDC1（CD138）和TNFRSF17（BCMA）在包括健康細(xì)胞的所有亞群中具有不同程度的表達(dá)（圖2b）。此外，大多數(shù)患者中都存在一些看似健康的多克隆漿細(xì)胞，這些細(xì)胞在PRMM患者中存在更高的異質(zhì)性（圖2c）。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜顯示，盡管每個患者都表現(xiàn)出獨特的轉(zhuǎn)錄特征，但驅(qū)動基因如CCND1、CCND2和FRZB27在PRMM和NDMM患者中均有高表達(dá)，兩組患者之間惡性漿細(xì)胞的驅(qū)動基因沒有顯著差異，因此推斷這些基因并非是造成耐藥性的分子因素（圖2d-e）。
 

2. 難治性和耐藥MM患者的應(yīng)激通路分析
通過Bootstrapping量化了NDMM、PRMM和健康對照組之間漿細(xì)胞的基因表達(dá)，在NDMM和PRMM患者的惡性漿細(xì)胞中共鑒定出66個差異基因，它們聚類形成了3個模塊，可以區(qū)分NDMM和PRMM的惡性漿細(xì)胞，并將PRMM分成group1和group2兩組（圖3a）。

模塊1中的基因包括一些已被報道的MM高危因子，如STMN1、PSMB4、RRM2和TYMS，以及新鑒定到的基因PPIA。模塊1中存在幾個高度富集的特定的通路，包括線粒體應(yīng)激基因COX6C、COX7A2、ER和UPR通路基因PPIA、STMN1、氧化應(yīng)激基因SOD1、TXN以及蛋白酶體通路基因PSMB4和PSMA2（圖3）。這些難治性和耐藥MM患者具有的獨特應(yīng)激通路可能與MM的耐藥性相關(guān)。
 

3. PRMM患者的特征可以預(yù)測對DARA–KRD治療
在臨床試驗中，41例PRMM患者接受了KYDAR藥物治療方案，這是一種高效的抗骨髓瘤四聯(lián)藥物方案，結(jié)果顯示治療效果在部分響應(yīng)（PR）及以上的患者生存期顯著延長（圖4a-b）。67%的KYDAR參與者表現(xiàn)出高風(fēng)險的細(xì)胞遺傳學(xué)畸變，后續(xù)通過FISH檢測評估了遺傳畸變對患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示具有大于一個畸變的患者生存期更短（圖4c-d）。

分析發(fā)現(xiàn)了區(qū)分PRMM隊列和NDMM患者的分子特征是與患者的預(yù)后相關(guān)，模塊1基因表達(dá)更高的分組患者的生存期更短（圖4e-f），說明這些分子特征與預(yù)后相關(guān)。綜合遺傳畸變和基因模塊分子特征兩個元素的多元模型可以更好地對藥物響應(yīng)情況進(jìn)行預(yù)測（圖4g-h）。
 

4. 廣泛耐藥MM患者的分子途徑
作者比較了KYDAR治療有應(yīng)答患者和無應(yīng)答患者之間的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)了可以分為兩個主要簇的133個差異基因，可用于區(qū)分應(yīng)答患者組和無應(yīng)答患者組（圖5a）。這些差異基因集中在上調(diào)基因與免疫調(diào)節(jié)、蛋白酶體、凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，可能與耐藥相關(guān)（圖5b-c）。分析顯示無應(yīng)答患者的特征基因在很大程度上與模塊1所處位置重疊，表明這兩組基因集和對應(yīng)患者之間存在高度重疊（圖5d）。
 

5. PPIA是MM患者的一個新靶點，具有廣泛的耐藥性機(jī)制。
PPIA編碼親環(huán)素A（Cyclophilin A），是一種參與蛋白質(zhì)折疊通路的酶。研究人員通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)PPIA在PRMM（圖3a-b）和KYDAR無反應(yīng)患者（圖5a-b）中均存在高表達(dá)，為了驗證PPIA是高耐藥患者的標(biāo)志物，還是作為潛在的耐藥基因參與了MM耐藥的分子機(jī)制，研究人員在MM惡性細(xì)胞系（RPMI- 8226）中通過CRISPR敲除了PPIA并進(jìn)行了耐藥實驗。實驗結(jié)果表明敲除PPIA或加入親環(huán)素A的小分子抑制劑CsA，都可以提高M(jìn)M細(xì)胞對蛋白酶體抑制劑CFZ的敏感性（圖7a-b）。在誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡中的作用，與CFZ或CsA單藥治療相比，聯(lián)合治療組的細(xì)胞凋亡顯著增加（圖7c-d）。

接下來，作者對CFZ、CsA處理后4、8小時的組合進(jìn)行了scRNA-seq分析，富集得到了7個細(xì)胞亞群（圖7e-f）。發(fā)現(xiàn)響應(yīng)藥物處理的細(xì)胞中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（如ATF3, ATF4, BAG3）和凋亡通路相關(guān)的基因（如DEDD2, DDIT4, GAS5）表達(dá)上調(diào)，而代謝相關(guān)的管家基因（如LDHA）則發(fā)生表達(dá)下調(diào)（圖7g）。與單獨使用CFZ相比，CFZ+CsA聯(lián)合處理的細(xì)胞基因表達(dá)水平變化更為顯著，幾乎所有的細(xì)胞都達(dá)到了凋亡階段，通過MM患者惡性漿細(xì)胞進(jìn)行的驗證也得到了一致的結(jié)果（圖7h-i），證明二者具有協(xié)同作用。進(jìn)一步明確細(xì)胞對CFZ的響應(yīng)和CFZ+CsA協(xié)同響應(yīng)的分子機(jī)制綜上所述，研究人員證明了PPIA確實參與到MM的耐藥過程中，且親環(huán)素A抑制劑可以協(xié)同克服MM細(xì)胞對于蛋白酶體抑制劑的耐藥性。
 

總結(jié)
本文通過將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析和臨床試驗相結(jié)合，確定了高耐藥性MM患者的分子特征，發(fā)現(xiàn)了多項與MM患者耐藥相關(guān)的機(jī)制，包括蛋白酶體機(jī)制、線粒體應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白質(zhì)折疊通路，并找到了新的潛在藥用靶點PPIA，提供了PPIA抑制劑可以和其它藥物聯(lián)用治療耐藥性MM的新思路。

參考文獻(xiàn)：
Cohen Y C , Zada M , Wang S Y ,et al.Identification of resistance pathways and therapeutic targets in relapsed multiple myeloma patients through single-cell sequencing[J].Nature Medicine, 2021, 27(3).DOI:10.1038/s41591-021-01232-w.