彗星電泳法檢測(cè)DNA損傷方法介紹
實(shí)驗(yàn)原理：
當(dāng)各種內(nèi)源性和外源性因素誘發(fā)細(xì)胞DNA鏈斷裂時(shí)，其超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA以及其他成分均擴(kuò)散到電解液中，而核DNA由于分子量太大不能進(jìn)入凝膠而留在原位。
檢測(cè)方法：
- 中性處理：在中性條件下，DNA維持雙鏈構(gòu)象，因而僅可以檢測(cè)雙鏈斷裂。
- 堿性處理：在堿性電解質(zhì)的作用下，DNA發(fā)生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來(lái)。由于這些DNA的相對(duì)分子質(zhì)量小且堿變性為單鏈，所以在電泳過(guò)程中帶負(fù)電荷的DNA會(huì)離開(kāi)核DNA向正極遷移形成彗星狀圖像。
實(shí)驗(yàn)操作：
1、將細(xì)胞固定于低熔點(diǎn)瓊脂糖中；
2、用裂解液破壞細(xì)胞膜；
3、再用堿溶液使DNA分子解旋；
4、將載玻片置于電泳液中，在電場(chǎng)的作用下，DNA分子向陽(yáng)極移動(dòng)。
結(jié)果分析：
1、如果DNA損傷嚴(yán)重，則產(chǎn)生的碎片就越多、越小，向陽(yáng)極遷移的DNA碎片量就越多，遷移距離也越長(zhǎng)，熒光染色后就能看見(jiàn)“彗星”樣尾長(zhǎng)并且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。
2、未受損傷的DNA大分子則由于細(xì)胞膜的阻隔，滯留在原處。
圖1．引自文獻(xiàn)
數(shù)據(jù)處理：
1、在拍照時(shí)以tif格式保存圖片，然后點(diǎn)擊下圖的綠色框選的位置導(dǎo)入文件。
2、打開(kāi)view下拉菜單，選“resultwindow”，在分析后您就可以看到您的結(jié)果窗口。分析之前最好把右側(cè)的head和tail選中，(紅色框選部分，這樣可以出現(xiàn)頭、尾分明的視覺(jué)效果)
3、用白色畫框選中要分析的區(qū)域
4、圖中數(shù)字表示：
1是翻頁(yè)，2是分析，3是保存，4是調(diào)整背景調(diào)整，5是進(jìn)入正式分析
調(diào)整好位置后，開(kāi)始分析前要點(diǎn)擊“5”，然后點(diǎn)“ 2”，再點(diǎn)“ 3 ”，這樣一張圖的數(shù)據(jù)就分析完了，數(shù)據(jù)會(huì)保存在系統(tǒng)里。點(diǎn)擊“翻頁(yè)”可以繼續(xù)分析下一張圖。
綠色框選所指區(qū)域是分析后的曲線，主曲線圖下面列舉了幾個(gè)數(shù)據(jù)，全部結(jié)果在結(jié)果窗口。
5、將分析窗口最小化(點(diǎn)擊下圖紅色框選部分)可以預(yù)覽分析好的數(shù)據(jù)
6、分析完所有圖片后導(dǎo)出數(shù)據(jù)保存成txt格式，保留TailDNA%(尾部DNA百分含量)，TailLength(尾長(zhǎng))，TailMoment(尾矩)三列數(shù)據(jù)，下圖為細(xì)胞展示圖。
7、根據(jù)彗星尾部熒光強(qiáng)度占總強(qiáng)度的百分比(TailDNA%)將采集的細(xì)胞圖像分為5個(gè)等級(jí)。
相關(guān)產(chǎn)品：
細(xì)胞損傷檢測(cè)試劑盒(彗星電泳法)(貨號(hào)：KFS210)
當(dāng)各種內(nèi)源性和外源性因素誘發(fā)細(xì)胞DNA鏈斷裂時(shí)，其超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA以及其他成分均擴(kuò)散到電解液中，而核DNA由于分子量太大不能進(jìn)入凝膠而留在原位。
檢測(cè)方法：
- 中性處理：在中性條件下，DNA維持雙鏈構(gòu)象，因而僅可以檢測(cè)雙鏈斷裂。
- 堿性處理：在堿性電解質(zhì)的作用下，DNA發(fā)生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來(lái)。由于這些DNA的相對(duì)分子質(zhì)量小且堿變性為單鏈，所以在電泳過(guò)程中帶負(fù)電荷的DNA會(huì)離開(kāi)核DNA向正極遷移形成彗星狀圖像。
實(shí)驗(yàn)操作：
1、將細(xì)胞固定于低熔點(diǎn)瓊脂糖中；
2、用裂解液破壞細(xì)胞膜；
3、再用堿溶液使DNA分子解旋；
4、將載玻片置于電泳液中，在電場(chǎng)的作用下，DNA分子向陽(yáng)極移動(dòng)。
結(jié)果分析：
1、如果DNA損傷嚴(yán)重，則產(chǎn)生的碎片就越多、越小，向陽(yáng)極遷移的DNA碎片量就越多，遷移距離也越長(zhǎng)，熒光染色后就能看見(jiàn)“彗星”樣尾長(zhǎng)并且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。
2、未受損傷的DNA大分子則由于細(xì)胞膜的阻隔，滯留在原處。
圖1．引自文獻(xiàn)數(shù)據(jù)處理：
1、在拍照時(shí)以tif格式保存圖片，然后點(diǎn)擊下圖的綠色框選的位置導(dǎo)入文件。
2、打開(kāi)view下拉菜單，選“resultwindow”，在分析后您就可以看到您的結(jié)果窗口。分析之前最好把右側(cè)的head和tail選中，(紅色框選部分，這樣可以出現(xiàn)頭、尾分明的視覺(jué)效果)
3、用白色畫框選中要分析的區(qū)域
4、圖中數(shù)字表示：
1是翻頁(yè)，2是分析，3是保存，4是調(diào)整背景調(diào)整，5是進(jìn)入正式分析
調(diào)整好位置后，開(kāi)始分析前要點(diǎn)擊“5”，然后點(diǎn)“ 2”，再點(diǎn)“ 3 ”，這樣一張圖的數(shù)據(jù)就分析完了，數(shù)據(jù)會(huì)保存在系統(tǒng)里。點(diǎn)擊“翻頁(yè)”可以繼續(xù)分析下一張圖。
綠色框選所指區(qū)域是分析后的曲線，主曲線圖下面列舉了幾個(gè)數(shù)據(jù)，全部結(jié)果在結(jié)果窗口。
5、將分析窗口最小化(點(diǎn)擊下圖紅色框選部分)可以預(yù)覽分析好的數(shù)據(jù)
6、分析完所有圖片后導(dǎo)出數(shù)據(jù)保存成txt格式，保留TailDNA%(尾部DNA百分含量)，TailLength(尾長(zhǎng))，TailMoment(尾矩)三列數(shù)據(jù)，下圖為細(xì)胞展示圖。
細(xì)胞損傷檢測(cè)試劑盒(彗星電泳法)(貨號(hào)：KFS210)
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