小鼠肺類器官對減少、增加和循環(huán)拉伸的反應(yīng)

大多數(shù)肺部疾病與肺某些區(qū)域的應(yīng)變降低（例如肺炎、特發(fā)性肺纖維化、先天性膈疝 （CDH）或增加（例如肺氣腫、哮喘）有關(guān)。胎兒腔內(nèi)氣管阻塞術(shù)（FETO）是一種新興的CDH治療方法，可以在宮內(nèi)達(dá)到改善肺發(fā)育的目的。美國辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心及辛辛那提大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊曾使用CDH和FETO作為肺力學(xué)重要性的案例研究，因為CDH，氣管阻塞（TO）和正常狀態(tài)分別代表三種不同的機(jī)械力學(xué)發(fā)育環(huán)境：拉伸應(yīng)變減少，拉伸應(yīng)變增加和循環(huán)拉伸應(yīng)變。這三種狀態(tài)在肺發(fā)育的細(xì)胞培養(yǎng)或類器官模型中均未被考慮。

體外力學(xué)模型主要集中在經(jīng)受單軸或雙軸應(yīng)變的二維（2D）表面上培養(yǎng)的細(xì)胞。這些還原論模型為特定細(xì)胞類型的機(jī)械反應(yīng)性提供了重要的見解。例如，在培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞中，瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員4（TRVP4）是關(guān)鍵的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子，而Piezo1在調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞分裂以響應(yīng)張力中很重要。然而，理解這些發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)的相對重要性和評估細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)相互作用是困難的。

該團(tuán)隊使用動物肺的體內(nèi)模型克服了其中的一些困難，但機(jī)械輸入不容易操縱，人類細(xì)胞也不容易研究。為了克服這些限制，其開發(fā)了兩種機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的肺類器官模型。第一種是類器官破壞（DIS）或佛司可林（FSK）誘導(dǎo)的類器官腫脹的簡單模型，以研究靜態(tài)應(yīng)變增加和減少的影響。FSK增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，并已被證明可引起人鼻上皮類器官的類器官腫脹。第二個模型是將循環(huán)拉伸應(yīng)用于類器官。這是第一篇描述減少、增加和循環(huán)的拉伸對肺類器官基因表達(dá)影響的研究。

FSK介導(dǎo)的腫脹和類器官破壞模型

為了在類器官模型中模擬氣管阻塞和先天性膈疝的影響，對小鼠肺類器官（mLOs）進(jìn)行了破壞和FSK介導(dǎo)的腫脹實驗。FSK在4小時和20小時誘導(dǎo)mLO橫截面積增加37%和59%，而破壞分別導(dǎo)致mLO橫截面積減少 48%和68%。對照mLO橫截面積在同一時間內(nèi)分別增加了7%和24%，與正常的類器官生長一致（圖1 A）。在破壞前（圖1 B）、破壞后立即（圖1 C）和破壞后20小時（圖1 D）進(jìn)行活細(xì)胞膜染色的mLOs雙光子共聚焦顯微鏡圖像顯示，類器官壁出現(xiàn)相當(dāng)大的破壞，類器官大小減小。

圖1   小鼠肺類器官（mLOs）FSK和破壞模型。

FSK和DIS小鼠肺類器官中機(jī)械敏感基因的鑒定

這種實驗方法的一個挑戰(zhàn)是區(qū)分那些對FSK敏感的基因和那些對機(jī)械敏感的基因，了解一些基因可能兩者兼而有之。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SK誘導(dǎo)了近三分之一的細(xì)胞外基質(zhì)基因，并且該實驗?zāi)Ｐ推�向于顯示機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)基因誘導(dǎo)。在排除FSK敏感基因之前，F(xiàn)SK / DIS和FSK緊密聚集在一起，但在去除這些基因后，F(xiàn)SK/DIS 與 DIS更緊密聚集在一起。僅使用DIS，F(xiàn)SK和對照組進(jìn)行基因集富集分析。排除這些轉(zhuǎn)錄本后，保留了11805個基因并進(jìn)行了分析。將轉(zhuǎn)錄本限制在校正P值<0.1且表達(dá)有兩倍變化的轉(zhuǎn)錄本中，F(xiàn)SK與對照組的轉(zhuǎn)錄本為715個，DIS與對照組的轉(zhuǎn)錄本為1081個，F(xiàn)SK與DIS的轉(zhuǎn)錄本為760個。
 

受FSK誘導(dǎo)的類器官腫脹和類器官破壞影響的通路和過程

令人驚訝的是，F(xiàn)SK 與對照組以及 DIS 與對照組數(shù)據(jù)集之間存在 344 個共享的 DEGs，被激活的基因主要參與細(xì)胞周期和先天免疫相關(guān)過程。

盡管FSK和DIS都改變了細(xì)胞骨架組織，但只有DIS下調(diào)了與管發(fā)育、呼吸系統(tǒng)發(fā)育和細(xì)胞粘附相關(guān)的過程。FSK與對照組相比沒有顯著差異，但DIS下調(diào)了許多與糖胺聚糖和鞘糖脂代謝相關(guān)的通路。DIS和FSK都增加了與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)，盡管系統(tǒng)中不存在免疫細(xì)胞。IPA分析鑒定了許多常見的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子，例如Yes相關(guān)蛋白（YAP）和FOXM1，與FSK相比，干擾素和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）在DIS中的預(yù)測調(diào)節(jié)作用降低。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了許多相同的調(diào)控元件，DIS中的干擾素反應(yīng)因子降低，泛素和趨化調(diào)節(jié)因子在DIS中增加。盡管集落刺激因子-2 （CSF2）、Erb-b2 受體酪氨酸激酶 2（ERBB2）和表皮生長因子受體（EGFR）等調(diào)節(jié)因子在 DIS 和 FSK 中均升高，但 FSK 中的調(diào)節(jié)因子通常更高，這表明 FSK 的細(xì)胞增殖受可溶性因子的影響更大。

為了驗證這些發(fā)現(xiàn)，對PCNA陽性細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)。與其他組相比，F(xiàn)SK mLOs顯示出細(xì)胞增殖增加的證據(jù)。總之，盡管這種mLO FSK和DIS實驗設(shè)計降低了識別FSK敏感基因變化的能力，但該模型表明，增加的機(jī)械應(yīng)變會激活細(xì)胞周期，盡管FSK不會促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞譜系基因和相關(guān)調(diào)控通路的發(fā)展，但DIS確實抑制了它們。
 

循環(huán)拉伸模型

為了表征mLO基因表達(dá)響應(yīng)循環(huán)拉伸的差異，開發(fā)了循環(huán)拉伸實驗裝置，該裝置可以在組織培養(yǎng)中對嵌入的肺類器官施加雙軸循環(huán)拉伸（0.1 Hz，10.25%，20h）。在未拉伸狀態(tài)和拉伸狀態(tài)之間可以觀察到明顯的mLO體積增加。使用雙光子共聚焦顯微鏡測量硅膠插入物內(nèi)基質(zhì)膠的高度和三個mLOs在基線和拉伸后的體積。結(jié)果表明，基質(zhì)膠高度的測量顯示體積減少了7.6%，但類器官體積的測量顯示體積增加了約50%。這些數(shù)據(jù)表明，將循環(huán)雙軸應(yīng)變應(yīng)用于mLOs會導(dǎo)致類器官體積的周期性變化。
 

循環(huán)機(jī)械拉伸對mLO基因表達(dá)的影響

實驗對類器官進(jìn)行了20小時的循環(huán)拉伸，并從這些mLOs 中提取RNA，mLO 承受相同大小的靜態(tài)拉伸以及不施加拉伸。PCA揭示了靜態(tài)和無拉伸mLOs之間的相似性，以及這兩組和循環(huán)拉伸mLOs具有良好的分離性（圖2 A）。由于靜態(tài)和無拉伸mLOs相似，將它們與對照循環(huán)拉伸mLOs進(jìn)行比較，以確定循環(huán)拉伸是否激活了與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和組織、細(xì)胞-基質(zhì)粘附和間質(zhì)發(fā)育相關(guān)的GO生物過程。結(jié)果表明，與先天免疫相關(guān)的過程下調(diào)（圖2 B）。GO分子功能項的統(tǒng)計學(xué)強(qiáng)度相對較弱，其中“蛋白激酶活性”增加，“單糖結(jié)合”和“氧化還原酶活性”降低最為顯著（圖2 C）。ToppGene通路分析發(fā)現(xiàn)，通過整合素進(jìn)行的細(xì)胞-基質(zhì)相互作用在循環(huán)拉伸中最為顯著地上調(diào)（圖2 D）。與靜態(tài)拉伸和無拉伸相比，循環(huán)拉伸降低了大量與肺上皮細(xì)胞相關(guān)的基因豐度，并增加了與平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞相關(guān)的基因數(shù)量（圖2 E）。與GO分子功能類似，基因家族分析受到統(tǒng)計功效的限制，fermitins 上調(diào)，peroxiredoxins 降低。Fermitins調(diào)節(jié)整合素-基質(zhì)相互作用。IPA上游調(diào)控（圖2 G）和主調(diào)控（圖2 H）分析結(jié)果表明：1）循環(huán)拉伸通過SIRT3改變組蛋白乙�；�；2）STAT信號，MAP激酶激活和轉(zhuǎn)化生長因子α上調(diào)；3）TGF-β和MyD88信號降低，microRNAs和長非編碼RNAs的變化可能介導(dǎo)許多觀察到的基因表達(dá)變化。這些數(shù)據(jù)表明，循環(huán)拉伸促進(jìn)從上皮細(xì)胞功能向細(xì)胞外基質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞的成熟和組織的轉(zhuǎn)變。
 

圖2   循環(huán)拉伸模型的mLOs分析。

循環(huán)拉伸對間充質(zhì)細(xì)胞變化的影響

已知許多由循環(huán)拉伸改變的通路在間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)育中很重要，因此實驗量化了在無拉伸、靜態(tài)拉伸或循環(huán)拉伸下的類器官嵌入20小時后α平滑肌肌動蛋白（αSMA）陽性和血小板衍生生長因子受體α（PDGFRα）陽性細(xì)胞的百分比。結(jié)果表明，循環(huán)拉伸導(dǎo)致αSMA陽性和αSMA-PDGFRα雙陽性細(xì)胞幾乎翻倍，但PDGFRα陽性細(xì)胞的總豐度沒有增加（與該受體在幾種細(xì)胞類型中表達(dá)一致，圖3 A-D）。這些數(shù)據(jù)支持循環(huán)拉伸在肺間充質(zhì)細(xì)胞成熟中的作用。

圖3   肺成纖維細(xì)胞在循環(huán)拉伸下的變化。
 

總之，研究發(fā)現(xiàn)，在該mLO模型中，增加和減少的靜態(tài)拉伸誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，應(yīng)變的不斷降低會下調(diào)許多肺部發(fā)育通路，而增加的應(yīng)變會激活細(xì)胞周期，但對肺部發(fā)育通路沒有影響。循環(huán)拉伸促進(jìn)幾種不同肺間充質(zhì)細(xì)胞譜系的發(fā)育，激活TGF-β和表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，并增加αSMA和PDGFRα陽性細(xì)胞的豐度。循環(huán)拉伸對于肺間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)過程很重要。
 

參考文獻(xiàn)：Joshi R, Batie MR, Fan Q, Varisco BM. Mouse lung organoid responses to reduced, increased, and cyclic stretch. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2022 Jan 1;322(1):L162-L173. doi: 10.1152/ajplung.00310.2020. Epub 2021 Dec 1. PMID: 34851724; PMCID: PMC8794016.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34851724/、
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