剪切和靜水應(yīng)力通過YAP介導(dǎo)的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)胎兒心臟瓣膜重塑

心臟瓣膜的發(fā)育始于內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），其中瓣膜內(nèi)皮細胞（VEC）獲得間充質(zhì)標志物并侵入內(nèi)皮下基質(zhì)形成心臟內(nèi)膜墊。EMT后，這些細胞增殖并分化成細胞外基質(zhì)（ECM），產(chǎn)生瓣膜間質(zhì)細胞（VIC）。通過VEC和VIC的精確調(diào)控，完全舒張的心內(nèi)膜墊經(jīng)過ECM重塑并拉長成細長的瓣葉。在此過程中，生長和重塑受到干擾會導(dǎo)致瓣膜畸形，從而導(dǎo)致臨床上相關(guān)的心臟缺陷。這種干擾的遺傳原因已經(jīng)被廣泛研究，但只能解釋不到 20% 的臨床病例。機械應(yīng)力在調(diào)節(jié)瓣膜發(fā)育中的重要性已得到廣泛認可。振蕩剪切應(yīng)力 （OSS）促進 EMT，其細胞和分子機制已得到充分了解。相比之下，機械力在臨床上重要的EMT之后的生長和重塑中的作用仍然知之甚少。

流動的血液在瓣膜上產(chǎn)生剪切和靜水應(yīng)力。剪切應(yīng)力與 VECs 直接接觸，而靜水應(yīng)力在瓣膜中引起壓縮力和拉伸力，并可傳遞到 VICs。已在成人組織中鑒定出多種機械敏感信號通路，但它們與瓣膜形態(tài)發(fā)生的關(guān)系尚不清楚。YAP信號是另一種被廣泛研究的機械活性通路，是Hippo 通路的轉(zhuǎn)錄輔因子。已知YAP信號通過促進心肌細胞增殖來調(diào)節(jié)心室發(fā)育。然而，它在 EndMT 后瓣膜形態(tài)發(fā)生中的作用知之甚少。此外，YAP通路是否對不同細胞類型的不同應(yīng)力做出不同的反應(yīng)，以及這些機械反應(yīng)如何協(xié)同調(diào)節(jié)多種細胞類型以實現(xiàn)特定的組織形態(tài)發(fā)生，尚不清楚。

最近，美國康奈爾大學(xué)梅尼格生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院研究組在《eLife》發(fā)表了題為“Shear and hydrostatic stress regulate fetal heart valve remodeling through YAP-mediated mechanotransduction”的文章，探討了剪切和靜水應(yīng)力調(diào)控瓣膜生長和重塑的機制。該團隊使用體外和離體模型來解耦剪切和靜水應(yīng)力對瓣膜尺寸和形狀的影響，還研究了YAP介導(dǎo)的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)在這些效應(yīng)中的作用。通過結(jié)合這些模型，詳細闡述了剪切和靜水應(yīng)力如何調(diào)節(jié)VEC和VIC，以確定瓣膜的合適尺寸和形狀。
 

YAP表達受時空調(diào)控

實驗首先收集了野生型小鼠不同發(fā)育階段的胚胎心臟，并檢查了心臟瓣膜中的YAP激活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在E11.5（胚胎期）時，YAP在流出道（OFT）和房室（AV）緩沖層的間質(zhì)和內(nèi)皮中均有表達。在E14.5時，VIC中YAP激活顯著升高，然后在E17.5時下降。在后期重塑階段，YAP激活的這種降低在房室瓣膜中是顯著的，但在左室瓣膜中不明顯，因為所有瓣膜的發(fā)育并不均勻。在流出側(cè)的VECs中，細胞核YAP表達在后期重塑階段顯著增加。盡管在流入側(cè)的VECs中，細胞質(zhì)YAP表達在所有階段都更強。

此外，還在漢堡-漢密爾頓（Hamburger–Hamilton stages）階段（HH）25、HH30和HH36檢測了雞胚胎心臟中YAP的活性，它遵循相同的時空模式。VICs中的YAP激活在HH30激增，然后在HH36下降。流出側(cè)的VECs具有上調(diào)的核YAP表達，而流入側(cè)VECs的YAP表達主要在細胞質(zhì)中。

進一步檢測YAP轉(zhuǎn)錄活性，以確定YAP激活的上游。與E11.5或HH25緩沖層相比，YAP靶基因THBS1，ANKRD1和PTX3在E14.5和HH31處分別升高了近10倍。這些基因的表達隨后在重塑的后期階段顯著降低。相比之下，LATS1/2（Hippo 通路中YAP的上游）的基因表達在瓣膜生長和重塑過程中幾乎沒有變化。這表明YAP活性在很大程度上獨立于Hippo 通路。

 

剪切和靜水應(yīng)力調(diào)節(jié)YAP活性

除了Hippo 通路的協(xié)同效應(yīng)外，YAP也是機械轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)。事實上，YAP的時空激活與機械環(huán)境的變化相關(guān)。在瓣膜重塑過程中，單向剪切應(yīng)力（USS）在瓣膜的流入表面上產(chǎn)生，其中YAP很少在VECs的核中表達（圖1 A）。另一方面，振蕩剪切應(yīng)力（OSS）在流出表面上發(fā)生，其中核YAP定位在VECs。VICs中的YAP激活也與靜水應(yīng)力相關(guān)。應(yīng)力在瓣膜尖端產(chǎn)生壓應(yīng)力（CS），其中核 YAP 定位在 VICs（圖1 B）。盡管拉伸應(yīng)力（TS）是在伸長區(qū)域產(chǎn)生的，但YAP在VIC核中不存在。

為了研究剪切應(yīng)力對VECs中YAP活性的影響，實驗將USS和OSS直接應(yīng)用于VECs，發(fā)現(xiàn)低OSS（2 dyn/cm2）促進 VEC 中的 YAP 核易位（圖1 C、E），而高USS （20 dyn/cm2）抑制了細胞質(zhì)中的YAP。

為了研究靜水應(yīng)力對VICs中YAP活化的影響，實驗使用具有不同滲透壓的培養(yǎng)基來模擬CS和TS。在不同負荷條件下培養(yǎng)HH27 AV緩沖層外植體24 h，發(fā)現(xiàn)梯形緩沖層呈球形（圖1 D）。TS加載后緩沖層顯著壓縮，VICs中YAP活化顯著低于CS加載的VICs（圖1 F）。

圖1   剪切應(yīng)力和靜水應(yīng)力調(diào)節(jié)YAP活性。

 

YAP的缺失限制了細胞增殖并促進瓣膜成形

為了研究YAP在瓣膜生長和重塑中的功能，在CS（促生長）和U（卸載）條件下添加了YAP的藥理學(xué)抑制劑維替泊芬（VP）。抑制YAP減小了緩沖層的大小。與在CS下培養(yǎng)的緩沖層的球形狀相反，在具有VP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的瓣膜保持其梯形形狀。進一步的研究表明，YAP的缺失顯著抑制了VIC的增殖。此外，YAP抑制顯著增強了VECs之間VE-鈣粘蛋白的表達。緩沖層通常只有一層內(nèi)皮，但YAP抑制的瓣膜顯示五層或更多層內(nèi)皮。

激活YAP促進細胞增殖并抑制瓣膜伸長

為了研究YAP的功能獲得性，在TS（促壓縮）和U條件下添加一個YAP 轉(zhuǎn)錄活性的特異激活劑PY-60。YAP激活扭轉(zhuǎn)了瓣膜在TS和U條件下的壓縮趨勢，并推動了瓣膜尺寸的增長（圖2 A、B）。所有瓣膜都呈球形，無論它們是生長還是被壓縮。pHH3染色顯示，無論加載條件如何，YAP活化顯著提高了VIC增殖（圖2 C、G）。VE-鈣粘蛋白在YAP活化的內(nèi)皮中的表達明顯弱于YAP被抑制的內(nèi)皮（圖2 D）。
 

圖2   激活YAP可促進細胞增殖，抑制瓣膜伸長。

 

抑制YAP促進體內(nèi)樣剛度增加

為了評估YAP在瓣膜剛度中的作用，實驗測量了VP或PY-60處理的緩沖層外植體的應(yīng)變能量密度。這種方法已被應(yīng)用測量不同發(fā)育階段雛雞胚胎瓣膜的機械性能。結(jié)果表明，從HH25到HH34，瓣膜剛度幾乎呈線性增長，幾乎每24小時翻一番。在這項研究中發(fā)現(xiàn)，抑制YAP在24小時培養(yǎng)期間也給出了類似的硬度增加（圖2 H）。盡管YAP激活和抑制都增加了瓣膜剛度，但激活YAP后瓣膜的剛度僅為抑制YAP時的一半。

 

體內(nèi)機械操作導(dǎo)致瓣膜缺損和YAP失調(diào)

為了操縱體內(nèi)的機械力，實驗在AV緩沖層生長的早期階段（HH24）進行了左心房結(jié)扎（LAL）。LAL限制了左心室的血流，導(dǎo)致左室瓣膜的血流動力學(xué)應(yīng)力和剪切應(yīng)力降低，但右室瓣膜的力增加。結(jié)果，LAL瓣膜和心臟（圖3 A）的尺寸小于對照瓣膜和心臟（圖3 B）。具體而言，LAL導(dǎo)致左房室間隔瓣發(fā)育不全且呈球形，而右房室間隔瓣過度發(fā)育和拉長。這與正常的瓣膜發(fā)育相反，在正常瓣膜發(fā)育期間，左房室瓣膜的尺寸要大得多，并且更細長（圖3 C）。對照組中YAP激活在左右AV中均較高，而LAL導(dǎo)致不平衡的YAP激活：右室AV YAP激活高，而左室AV激活顯著降低（圖3 D）。

圖3   中斷的生物力學(xué)改變了YAP的激活并導(dǎo)致體內(nèi)瓣膜缺損。

 

圖4   剪切應(yīng)力和靜水應(yīng)力的局部協(xié)作可以通過YAP信號引導(dǎo)復(fù)雜的形態(tài)發(fā)生。

（A）房室管或 OFT 中對稱心內(nèi)膜墊的模型。（B）模型的橫截面顯示流動的血液在緩沖層上產(chǎn)生靜水應(yīng)力和剪切應(yīng)力。（C）振蕩剪切應(yīng)力（OSS）和壓應(yīng)力（CS）分別促進了VEC和VIC的YAP核易位。單向剪切應(yīng)力（USS）抑制了YAP核易位。CS通過刺激間充質(zhì)細胞的增殖來促進緩沖層生長。（D）剪切應(yīng)力通過調(diào)節(jié)VECs之間的細胞-細胞粘附來驅(qū)動緩沖層重塑為小葉結(jié)構(gòu)。（E）拉伸應(yīng)力（TS）抑制YAP核易位與USS共同作用，形成緊湊而細長的形態(tài)。

總之，該研究表明，剪切應(yīng)力和靜水應(yīng)力的時空協(xié)調(diào)機械轉(zhuǎn)導(dǎo)是瓣膜生長和重塑所必需的。剪切應(yīng)力和靜水應(yīng)力可以通過YAP通路調(diào)節(jié)VEC張力和VIC增殖，從而決定瓣膜的尺寸和形狀。功能失調(diào)的YAP信號可能導(dǎo)致瓣膜畸形，但不正確的局部機械信號傳導(dǎo)會帶來更重要的畸形風(fēng)險，即使YAP信號功能齊全且沒有基因突變。其中所提出的機械生物學(xué)系統(tǒng)還可以通過影響力或在特定階段靶向YAP通路來控制瓣膜生長和改變瓣膜形狀。

參考文獻：Wang M, Lin BY, Sun S, Dai C, Long F, Butcher JT. Shear and hydrostatic stress regulate fetal heart valve remodeling through YAP-mediated mechanotransduction. Elife. 2023 Apr 20;12:e83209. doi: 10.7554/eLife.83209. PMID: 37078699; PMCID: PMC10162797.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37078699/

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